Generazione di un modello sferoidale tridimensionale dell'invasione delle cellule tumorali

Abstract

Fonte: Guyon, J., et al. Un modello sferoidale 3D per il glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)

Il video dimostra la generazione di un modello sferoidale tridimensionale dell'invasione delle cellule tumorali. Gli sferoidi sono formati da cellule tumorali cerebrali umane e incorporati in una matrice di collagene. Le cellule tumorali alla periferia sferoidale adottano un fenotipo invasivo, secernendo proteasi per degradare il collagene e avanzando per invadere la matrice circostante.

Protocol

1. Generazione di sferoidi tumorali di dimensioni uniformi

NOTA: Le cellule staminali vengono coltivate in terreno neurobasale integrate con integratore di B27, eparina, fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF-2), penicillina e streptomicina. Queste cellule formano spontaneamente sferoidi in coltura.

1. Lavare le cellule tumorali con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e incubare le cellule con 0,5-1 mL di enzima di dissociazione per 5 minuti a 37 °C.
2. Lavare con 4-4,5 mL di PBS e aggiungere 10 mL del terreno di crescita completo (terreno neurobasale completo, cNBM).
3. Contare le cellule utilizzando una tecnica di conteggio automatico con blu di tripano e un vetrino della camera di conteggio delle cellule.
4. Per generare 100 sferoidi con 10⁴ cellule per sferoide (in base alla dimensione preferita), mescolare 10⁶ cellule in 8 mL di NBM con 2 mL di metilcellulosa al 2%.
5. Trasferire la sospensione in un contenitore per sistemi sterili ed erogare 100 μL/pozzetto con una pipetta multicanale in una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti.
6. Incubare la piastra a 37 °C, 5% di CO₂ e 95% di umidità. Si formeranno sferoidi di uguali dimensioni che possono essere utilizzati dopo 3-4 giorni.

2. Esperimenti tridimensionali

1. Invasione
   1. Preparazione
      1. Preparare la matrice di collagene in una provetta su ghiaccio con collagene di tipo I alla concentrazione finale di 1 mg/mL, 1x PBS, 0,023xV _collagene, 1 M di idrossido di sodio e H₂O. Incubare la soluzione su ghiaccio per 30 min.
      2. Raccogliere gli sferoidi dalla piastra rotonda del pozzetto inferiore in provette da 500 μL e lavare 2 volte con 200 μL 1x PBS.
      3. Pipettare accuratamente gli sferoidi in 100 μl di matrice di collagene e inserirli al centro di un pozzetto in normali piastre da 96 pozzetti.
      4. Incubare il gel di collagene per 30 minuti a 37 °C e poi aggiungere cNBM sopra il gel. Inibitori o attivatori (ad esempio, acido cloridrico come mostrato in Figura 1B, 1C) possono essere aggiunti al mezzo in questo passaggio.
   2. Acquisizione e analisi delle immagini
      1. Scatta foto in sequenza con un microscopio video in modalità campo chiaro 24 ore dopo l'inclusione del collagene.
      2. Usa le Fiji per analizzare le immagini manualmente o in modo semiautomatico. Per farlo manualmente, disegna intorno al nucleo e all'area totale dello sferoide con lo strumento di selezione a mano libera e misura l'area invasiva di ogni sferoide sottraendo l'area totale con l'area del nucleo. Per analizzare le immagini in modo semiautomatico, utilizzare una macro per determinare l'area invasiva.

Results

Figura 1: Glioblastoma P3 sferoide in saggi di proliferazione, invasione o migrazione. (A) Saggio di proliferazione. Pannello di sinistra: Immagini rappresentative con DMSO come controllo o con 20 μM di rotenone (inibitore del complesso respiratorio I) al tempo 0 o 72 h. Pannello di destra: Quantificazione dell'area sferoidale rappresentata da linee tratte...

Materials