Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Estrazione di α-sinucleina (αS) da regioni cerebrali sezionate
- Sezionare un intero cervello in una capsula di Petri di plastica da 35 mm su ghiaccio con una lente d'ingrandimento a bassa potenza (ingrandimento 8X) utilizzando due forcipi le cui estremità sono tenute insieme tranne quando si seziona l'ippocampo. Non superare i 10 minuti per preservare l'integrità del cervello. Posiziona il cervello con il lato destro rivolto verso l'alto e recupera le seguenti regioni cerebrali in questo ordine:
- Separa uno dei due bulbi olfattivi usando una pinza posizionata appena dietro di esso. Staccalo dal cervello spostandolo verso il basso. Ripetere questa operazione per la seconda lampadina.
- Incastra delicatamente la pinza tra le due cortecce e spostala in avanti per facilitare la dissociazione delle due corteccia. Mantenendo il cervello in posizione con una pinza, usane un'altra per separare la corteccia dall'ippocampo.
- Posizionare la pinza 2 mm sotto la corteccia. Mantieni una leggera pressione sulla pinza fino a quando la parte superiore dell'ippocampo non è visibile. Stacca la prima parte della corteccia e ripeti con la seconda parte. Usa il forcipe per separare le due cortecce partendo dall'ippocampo e spostandoti verso la parte anteriore del cervello.
- Posizionare la pinza aperta attorno a uno degli ippocampi. Chiudi la pinza nella parte inferiore dell'ippocampo quindi rimuovila delicatamente, recuperando il più possibile. Ripetere la procedura per il secondo ippocampo.
- Posiziona la pinza aperta sotto una delle striate e separala delicatamente dal cervello. Usa il forcipe per rimuovere la corteccia rimanente dallo striato. Ripetere questa procedura per il secondo striato.
- Usa la pinza per premere delicatamente il contorno del cervelletto di 2 mm per facilitarne la separazione dal cervello. Posiziona la pinza appena dietro il cervelletto e rimuovila spostando la pinza in avanti.
- Usa la parte larga della pinza per sollevare il mesencefalo in modo da vedere chiaramente dove si unisce al tronco encefalico. Praticare un'incisione verticale all'incrocio, quindi rimuovere il tronco encefalico.
- Posizionare la pinza dietro il mesencefalo, che è composto da quattro strutture arrotondate. Incidere verticalmente fino a quando il mesencefalo non è stato completamente separato dal cervello rimanente.
- Preparare omogeneizzati di percentuale variabile (peso/volume) in tampone ad alto contenuto di sale (HS), a seconda del numero di tessuti disponibili: 5% di omogenato per un peso compreso tra 10 e 30 mg, 10% per un peso compreso tra 30 e 80 mg e 20% per un peso superiore a 80 mg.
- Aggiungere un volume adeguato di tampone HS alle regioni cerebrali sezionate per ottenere la % prevista di omogeneizzato.
- Agitare e verificare che i tessuti siano completamente immersi nel tampone HS.
- Omogeneizzare i campioni preparati dalle regioni cerebrali sezionate o dal midollo spinale cervicale con un trituratore di tessuti composto da un tubo di vetro borosilicato e due pestelli, A e B.
- Versare ogni regione del cervello da frantumare direttamente nel tubo. Inserire il pestello A nel tubo e ritrarlo. Ripeti questo movimento una decina di volte per dissociare il tessuto. Quindi utilizzare il pestello B per continuare a macinare il tessuto con altri 20 movimenti. Trasferire gli omogeneizzati in una provetta da 1,5 ml con una pipetta di trasferimento da 1 ml.
- Centrifugare i campioni a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C per eliminare eventuali frammenti cerebrali non macinati. Recuperare i surnatanti, dividerli in aliquote da 200 μl e mantenerli a -80 °C per le successive analisi.
1. Rilevamento di αS mediante ELISA
- Diluire gli anticorpi del rivestimento a 0,01 ng/ml. Utilizzare l'anticorpo policlonale di coniglio anti-αS o l'anticorpo clone monoclonale 42 in 50 mM di tampone Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,6).
- Rivestire le micropiastre a 96 pozzetti con 100 μl per pozzetto di questa soluzione di rivestimento e lasciarle a 4 °C O/N. Utilizzare l'anticorpo policlonale di coniglio anti-αS nella soluzione di rivestimento per ELISA utilizzando gli anticorpi di rilevamento syn514, clone 42, LB509, AS11, 4D6 o 8A5. Utilizzare l'anticorpo monoclonale anti-αS clone 42 come soluzione di rivestimento in combinazione con l'anticorpo di rilevamento anti-pSer129 αS.
NOTA: Se necessario, le piastre possono essere conservate a 4 °C per una settimana prima dell'esecuzione dell'ELISA. - Utilizzare una lavatrice per piastre per lavare le piastre cinque volte con 300 μl di soluzione salina tamponata con fosfato con lo 0,05% di Tween 20 (PBST) per pozzetto. Da questa fase in poi, l'incubazione avviene a RT.
- Aggiungere 200 μl di tampone bloccante T20 PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) per pozzetto. Agitare per 1 ora a 150 giri/min. Lavare le piastre cinque volte con PBST.
- Diluire gli omogeneizzati cerebrali (diluizione 1:100 degli omogenati al 20%, 1:50 degli omogenati al 10% e 1:25 degli omogeneizzati al 5% in PBST BSA 1%) e aggiungere 100 μl a ciascun pozzetto. Quindi incubare per 2 ore agitando a 150 giri/min. Lavare le piastre cinque volte con PBST.
- Aggiungere i diversi anticorpi αS di rilevazione nella PBST con albumina sierica bovina (BSA) all'1% alle diluizioni indicate nell'elenco dei materiali. Incubare per 1 ora a 150 giri/min. Lavare le piastre cinque volte con PBST.
- Aggiungere coniugati HRP IgG anti-topo o anti-coniglio diluiti 1:8.000 in PBST integrati con BSA 1% per 1 ora agitando a 150 giri/min. Lavare le piastre cinque volte con PBST.
- Aggiungere 100 μl di soluzione di 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) a ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti al buio agitando a 150 giri/min.
- Arrestare la reazione aggiungendo 100 μl di HCl 1 N per pozzetto, quindi misurare l'assorbanza a 450 nm con il lettore di micropiastre.
- Per l'analisi dei dati, sottrarre il valore OD ottenuto in un pozzetto con tutti i reagenti, ad eccezione di eventuali campioni di cervello di topo (pozzetto vuoto) dai valori OD misurati per ciascuno dei campioni analizzati.