Modellazione delle metastasi del tumore cerebrale tramite iniezione di cellule tumorali nell'arteria carotide interna

Abstract

Fonte: Lim, M., et al. Modellazione delle metastasi cerebrali mediante iniezione di cellule tumorali nell'arteria carotide interna. J. Vis. Exp. (2022)

In questo video, un topo anestetizzato viene sottoposto a una procedura chirurgica in cui le cellule tumorali vengono iniettate nell'arteria carotide comune (CCA) per facilitare la consegna mirata al cervello. La procedura prevede la sutura e la manipolazione precise delle arterie carotidi per dirigere le cellule iniettate verso l'arteria carotide interna (ICA), promuovendo la formazione di tumori nel cervello nel tempo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione di cellule tumorali per l'iniezione

NOTA: In questo studio è stata utilizzata la linea cellulare di cancro al seno umano, BT-474 (BT474). BT474 è stato coltivato in un terreno di crescita completo comprendente RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di insulina. Le celle sono state mantenute in un incubatore a 37 °C con il 5% di anidride carbonica nell'atmosfera atmosferica. Autenticare la linea cellulare mediante test ripetuti in tandem satellitare, confermare l'espressione della proteina reporter (ad es. luciferasi), se presente, e verificare la presenza di infezione da micoplasma.

1. Seminare le cellule tumorali BT474 a una densità di semina di 2,0 × 10^6 cellule in un pallone T75 utilizzando 10 mL di terreno di coltura completo e coltura (a 37 °C con il 5% di anidride carbonica) al 70%-80% di confluenza prima dell'iniezione.
2. Il giorno dell'iniezione, scartare il terreno di coltura e lavare due volte il monostrato cellulare con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
3. Aggiungere 5 mL di reagente di dissociazione per colture cellulari preriscaldato e incubare a 37 °C per 5 minuti o fino a quando le cellule non si sono staccate. Dopo 5 minuti, picchiettare delicatamente il pallone per favorire il distacco delle cellule.
4. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura completo contenente il 10% di siero fetale bovino per estinguere l'attività del reagente di dissociazione.
5. Risospendere delicatamente le cellule mediante pipettaggio per ridurre i grumi cellulari.
6. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL e centrifugare a 180 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
7. Decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) senza calcio e magnesio per ridurre al minimo l'aggregazione cellulare.
8. Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente a 180 x g per 3 min.
9. Decantare il surnatante per rimuovere il siero/reagente di dissociazione residuo e risospendere il pellet cellulare in 3 mL di HBSS.
10. Posizionare un colino cellulare da 100 μm su una provetta conica fresca da 50 mL e far passare la sospensione cellulare per rimuovere i grumi cellulari.
    NOTA: Una sospensione unicellulare è essenziale per ridurre al minimo l'occlusione dei vasi sanguigni e il rischio di ictus durante l'iniezione.
11. Calcola il numero di cellule vitali utilizzando l'esclusione del Trypan Blue e un emocitometro utilizzando metodi standard.
12. Diluire la sospensione cellulare con HBSS a una concentrazione cellulare di 2,5 x 10⁶} cellule/mL.
13. Mantenere il tubo orizzontale sul ghiaccio e farlo oscillare delicatamente periodicamente per ridurre al minimo la formazione di grumi. La sospensione della cella può essere conservata su ghiaccio per un massimo di 6 ore.
    NOTA: L'oscillazione è stata eseguita manualmente, ma questo può essere fatto anche utilizzando uno shaker a bassi regimi.

2. Preparazione del topo per la procedura

NOTA: In questo studio, sono stati utilizzati topi scid femmina NOD di 4-5 settimane. Introdurre cibo per il recupero con dieta morbida (ad es. gel dietetico, idrogel, purè di cibo per topi) ai topi 3 giorni prima della procedura per incoraggiare l'alimentazione dopo la procedura.

1. Strumenti chirurgici per autoclave. Spruzzare e pulire l'area chirurgica e l'attrezzatura con un disinfettante per superfici, seguito da etanolo al 70%.
2. Posiziona un tappetino riscaldante per animali sotto la tavola chirurgica per prevenire l'ipotermia. Accenderlo 30 minuti prima dell'intervento. Spruzzare e pulire il tavolo chirurgico con un disinfettante per superfici, seguito da etanolo al 70%.
3. Prepara una gabbia per animali pulita e un termoforo caldo per il recupero.
4. Indossare dispositivi di protezione individuale puliti (camice, maschera, retina per capelli e guanti). Mantenere la sterilità durante tutta la procedura utilizzando guanti da esame puliti e una tecnica "solo punte per strumenti".
5. Anestetizzare il topo con una camera anestetica utilizzando isoflurano al 5% con un flusso di ossigeno di 2 L/min fino a quando il topo non perde il riflesso del pedale.
6. Portare l'animale fuori dalla camera e posizionarlo in un cono nasale che eroga isoflurano al 2% con un flusso di ossigeno di 2 L/min per la procedura chirurgica rimanente.
7. Mouse da punzone per l'orecchio per l'identificazione e l'uso di tosatrici elettriche per radere la pelliccia dalla regione del collo. Pulisci i peli in eccesso dalla pelle esposta usando del nastro adesivo.
8. Pesare il mouse per calcolare le dosi di anestetico e analgesico necessarie. Somministrare buprenorfina e meloxicam rispettivamente a 50 μg/kg e 1 mg/kg tramite iniezione sottocutanea.
9. Trasferisci il mouse su una tavola chirurgica calda e fissa il cono del naso con del nastro adesivo.
10. Applicare lubrificante oculare sugli occhi per evitare che si secchino.
11. Fissare delicatamente il mouse agganciando prima i denti dell'incisivo superiore utilizzando un filo fissato con nastro adesivo al pannello chirurgico, quindi fissando con nastro adesivo le zampe anteriori e posteriori. Questo passaggio estende il corpo e mantiene il collo dritto durante la procedura.
12. Eseguire la preparazione della pelle preoperatoria come descritto di seguito.
    1. Pulire il collo con un antisettico topico (povidone-iodio) per ridurre il carico di microflora cutanea e rimuovere i peli sciolti. Pulire dal centro della pelle, lavorando verso l'esterno per evitare la ricontaminazione del sito di incisione. Ripetere il processo utilizzando etanolo al 70%. Eseguire tre cicli alternati di iodio ed etanolo per la disinfezione.
    2. Stendi un telo chirurgico sull'animale. Questo viene tagliato e modellato da un pezzo di tovagliolo di carta sterile o da un sacchetto per autoclave.
13. Stendere asciugamani di carta sterili o sacchetti per autoclave per strumenti chirurgici.
14. Verificare la presenza di riflessi via 'Test di pizzicamento' per garantire un'anestesia sufficiente prima di continuare la procedura.

3. Iniezione carotidea interna

NOTA: In questo esperimento, sono stati utilizzati una cannula per infusione da 31 G e una configurazione siringa-driver attivata dal piede per facilitare la procedura di iniezione. Questa configurazione è facoltativa e l'utente può utilizzare una siringa da insulina da 31 G e saltare i passaggi 3.11 e 3.12. Per preparare la cannula per infusione, tirare e separare la parte dell'ago dalla parte di raccordo della siringa di un ago da 31 G utilizzando due paia di pinze per sutura. Quindi, collegare la parte dell'ago a un'estremità di un tubo per infusione sottile lungo circa 10 cm.

1. Posizionare il microscopio di dissezione sopra il mouse.
2. Usando le forbici, praticare un'incisione verticale di 15 mm lungo la linea mediana nella regione del collo partendo da 5 mm sotto la mascella fino all'ingresso toracico.
3. Usando due paia di pinze angolate, separare la pelle e le ghiandole salivari sottostanti e applicare i divaricatori per mantenere la trachea esposta. Il passaggio successivo esporrà la guaina carotidea che si trova parallela alla trachea.
4. Usando due paia di pinze ad angolo fine, sezionare senza mezzi termini il muscolo e il tessuto adiposo adiacenti alla trachea per esporre la guaina carotidea destra. La guaina carotidea è lo strato fibroso che copre l'arteria carotide comune, la vena e il nervo vago, e questo fascio può essere visualizzato dall'arteria carotide comune di colore rosso vivo. In questo studio, l'iniezione è stata eseguita sull'arteria carotide destra.
5. Eliminare un segmento dell'arteria carotide comune caudale alla biforcazione carotidea della fascia circostante e separarlo dal nervo vago e dalle vene.
6. Isolare e liberare la biforcazione carotidea (la giunzione che unisce le arterie carotidi esterna e interna) dai nervi e dalla fascia circostanti. Posizionare una pinza sottile sotto l'arteria carotide esterna e far passare una sutura di seta (spessore 5-0) sotto l'arteria. Annodare e stringere la sutura e tagliare la linea in eccesso.
   NOTA: Questa legatura (L1) impedirà all'iniettato di transitare attraverso l'arteria carotide esterna.
7. Posizionare una pinza sottile sotto l'arteria carotide comune e far passare una sutura di seta (spessore 5-0) sotto l'arteria. Fare un nodo e stringere la sutura in una posizione prossimale al sito di iniezione proposto. Tagliare la sutura in eccesso, lasciando circa 10 mm di filo.
   NOTA: Questa seconda legatura (L2) limiterà il flusso sanguigno e il sanguinamento dopo l'iniezione. Viene anche utilizzato per posizionare e trattenere l'arteria carotide durante l'iniezione.
8. Tagliare e inumidire una striscia di tergicristalli usa e getta (autoclavati) a basso contenuto di lanugine di circa 10 mm x 5 mm. Piegare la striscia in 4 mm x 5 mm, con uno spessore di 2-3 mm, e posizionarla sotto l'arteria carotide nel sito di iniezione proposto. Questo sosterrà il vaso durante l'iniezione.
9. Sul rostrale dell'arteria carotide comune fino al sito di iniezione proposto, posizionare una terza legatura (L3) con un nodo sciolto. Questo viene serrato solo dopo l'iniezione (al punto 3.16).
10. Agitare delicatamente la sospensione cellulare e aspirare 200 μl di sospensione cellulare in una siringa da insulina (con un ago da 31 G).
11. Caricare la siringa nel driver della siringa, che è collegato a un pedale di attivazione.
12. Collegare una cannula sottile con un ago da 31 G alla siringa e innescare la linea.
13. Controllare se l'arteria carotide è ben posizionata e pressurizzata.
14. Utilizzando due pinze ad angolo sottile, una che tende delicatamente l'estremità della prima legatura e l'altra che tiene l'ago da 31 G, inserire lentamente l'ago con lo smusso verso l'alto nel lume del vaso sanguigno facendo attenzione a non perforarlo.
15. Iniettare lentamente 100 μL di sospensione cellulare (dal passaggio 1.13) nell'arteria carotide comune a 10 μL/s. Questo fornirà 2,5 × 10^5 cellule nel vaso sanguigno. L'iniezione riuscita viene visualizzata tramite la pulizia del sangue dal vaso sanguigno carotideo.
16. Sollevare e stringere delicatamente la legatura libera (L3) (dal punto 3.9) subito dopo aver ritirato l'ago per evitare il riflusso e il sanguinamento. Taglia la sutura in eccesso.
    NOTA: È normale osservare una piccola quantità di sangue che sgorga dopo il ritiro dell'ago. Tuttavia, non ci deve essere alcun sanguinamento attivo dopo che la terza legatura è stata stretta.
17. Rimuovere il pezzo di tergicristalli usa e getta a basso contenuto di lanugine inumiditi.
18. Utilizzando una pipetta P200, sciacquare la cavità chirurgica due volte con 150-200 μL di acqua sterile o soluzione fisiologica.
19. Controllare di nuovo la presenza di sanguinamento, quindi rimuovere i divaricatori.
20. Riposizionare i tessuti molli, le ghiandole salivari e la pelle sopra l'arteria carotide e la trachea.
21. Chiudere lo strato cutaneo dell'incisione utilizzando un supporto per ago da sutura, una pinza e una sutura monofilamento 6/0 assorbibile o non assorbibile in uno schema continuo.
22. Gettare la siringa dell'ago della cannula e preparare una nuova configurazione per il mouse successivo. L'uso di una nuova siringa assicurerà che il numero di cellule iniettate in ciascun topo sia costante.
    NOTA: istantanee rappresentative della procedura sono in Se il vaso viene perforato o strappato dall'ago, indicato dalla perdita di iniettato o sanguinamento, la procedura è considerata non riuscita. Successivamente, l'ago deve essere ritirato e la terza legatura deve essere immediatamente serrata per evitare ulteriori sanguinamenti. Se il sanguinamento è persistente dopo il serraggio della sutura, l'animale deve essere soppresso con pentobarbital.

4. Recupero post-iniezione

1. Iniettare buprenorfina (50 μg/kg) e meloxicam (1 mg/kg) tramite iniezione sottocutanea come sollievo dal dolore post-chirurgico.
2. Sposta l'animale in una gabbia calda e pulita per riprendersi dall'anestesia. È normale che un animale abbia un'attività attenuata (rannicchiato e inattivo o che si muove lentamente) dopo il risveglio.
3. Dopo 30-45 minuti, trasferire i topi in una struttura di detenzione a lungo termine.
4. Fornire ai topi una dieta morbida (gel dietetico, idrogel, purè) per almeno una settimana dopo l'intervento chirurgico e controllare lo stato fisico ogni giorno con particolare attenzione ai segni di ictus, infezione e sanguinamento intorno al sito della ferita.
5. Due giorni dopo l'intervento, è tipico che l'animale abbia un'attività ridotta, un pelo leggermente arruffato e abbia perso il 15% del peso corporeo pre-operatorio. Somministrare analgesico (meloxicam) ogni giorno per 2-3 giorni dopo l'intervento chirurgico per gestire il dolore e favorire il recupero.
6. Dal 3° giorno in poi, gli animali devono aver riacquistato attività, aumentato la frequenza di alimentazione e toelettatura e riacquistato peso. Eutanasia negli animali con deficit persistenti della condizione fisica (dolore, rannicchiati, inattivi, perdita di peso) dopo 4 giorni dall'intervento chirurgico iniettando pentobarbital sodico a 200 mg/kg tramite iniezione intraperitoneale .
7. L'attecchimento e la progressione del tumore possono essere monitorati utilizzando l'anestesia e la modalità di imaging di scelta, come l'imaging bioluminescente, la risonanza magnetica o la PET/MRI. Il requisito e la capacità di intraprendere tale imaging dipenderanno intrinsecamente dagli obiettivi del singolo progetto e dalla struttura all'interno della quale viene intrapreso, e a seconda del tipo di reporter, tag, delle linee cellulari utilizzate, dell'accessibilità delle pertinenti strutture di radiochimica e imaging nucleare.
   NOTA: Alcuni animali potrebbero non rispondere bene e subire un ictus nonostante una procedura riuscita. Dopo la procedura, gli animali che presentano sintomi di disagio neurologico (girare la testa e tirare da un lato, comportamento in cerchio, rotolare, dimenarsi, perdita della funzione motoria) devono essere soppressi immediatamente.

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo di iniezione dell'arteria carotide interna per le metastasi cerebrali. L'iniezione dell'arteria carotide interna con legatura esterna dell'arteria carotide può produrre in modo affidabile un modello di metastasi cerebrali da vari tumori primari. In questo protocollo, tre legature sono posizio...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II siringa da insulina	BD	326103
Pinze angolate	Proscitech	T67A-SS	Fine appuntito, angolato senza dentellature, punta da 18mm, lunghezza 128 mm
Tappetino
Antibiotico e antimicotico	ThermoFisher Scientific	15240062
BT-474 (HTB-20) linea cellulare per cancro al seno	ATCC	HTB-20
Buprenorfina (TEMGESIC)
Contatore di cellule Countess	ThermoFisher Scientific	C10227
Microscopio
Ear perforatore
Tosatrici
Pinze angolate fini	Proscitech	DEF11063-07	Angolato 45°, Punta liscia, Larghezza punta: 0.4 mm, Dimensione punta: 0.4 x 0.3 mm, lunghezza 9cm
Tubo sottile per cannula, Tubo OD (in) 1/32, Tubo ID (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Siero bovino fetale	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution senza calcio e magnesio	ThermoFisher Scientific	14170120
Isoflurane
Kimwipes Tergicristalli monouso a basso contenuto di lanugine	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Cour
Meloxicam (METACAM)
Nose cone			Ricavato da un tubo
Lubrificante oculare PAA (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Soluzione di iodio povidone	Betadine	2505692
PPE (guanto, maschera, camice, retina per capelli)
Divaricatori	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Sutura in seta 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Soluzione salina normale sterile	ThermoFisher Scientific	TM4469
Nastro
Tavola			Un tagliere avvolto con una borsa autoclavabile.
Forbici chirurgiche	Proscitech	T104	Dimensioni punta (LxD): 38x7mm, lunghezza 115mm
Pinza per sutura/ Pinza Brophy curva	Proscitech	T113C	Curvo, punta stretta arrotondata da 2 mm, con dentellature, lunghezza 165 mm
Porta ago da sutura (porta ago Olsen Hegar)	Proscitech	TC1322-180	lunghezza 190 mm, morsetto a cricchetto
Driver siringa con pedale/ Pompa ultra micro UMP3	World Precision Instruments	UMP3-3
Pallone per coltura tissutale T75	ThermoFisher Scientific	156499 <
Trigene II disinfettante per superfici	Ceva

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