Questo video mostra l'analisi di campioni di peptidi da granuli di neuromelanina (NMG) isolati da tessuto cerebrale umano post-mortem. I peptidi vengono prima separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e quindi analizzati mediante spettrometria di massa per determinare i loro rapporti massa/carica (m/z). I peptidi bersaglio vengono frammentati per identificare le modificazioni post-traduzionali e i dati risultanti vengono confrontati con un database di riferimento per determinare il profilo proteomico degli NMG.
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Articolo metodologico
Analisi LC-MS/MS del profilo proteomico di granuli di neuromelanina isolati da tessuto cerebrale umano
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28 aprile 2025
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Digestione triptica
1. Scongelare i campioni con ghiaccio.
2. Asciugare completamente i campioni in un concentratore sottovuoto.
3. Riempire il campione con 50 μl di un tampone di digestione adatto, ad es. 50 mM di bicarbonato di ammonio.
4. Dopo l'aggiunta di 1,25 μl di 200 mM di 1,4-ditiotreitolo, incubare i campioni per 30 minuti a 60 °C e 300 giri/min utilizzando un termomiscelatore e successivamente raffreddarli a temperatura ambiente (RT).
5. Quindi, incubare i campioni a RT per 30 minuti al buio dopo l'aggiunta di 1,36 μL 0,55 M di iodoacetammide.
6. Aggiungere una quantità adeguata di tripsina ai campioni e incubare i campioni per una notte (~16 h) a 37 °C.
NOTA: Per 1.000.000 μm2, 0,1 μg di tripsina sono risultati sufficienti.
7. Aggiungere 2,6 μl di acido trifluoroacetico (TFA) al 10% ai campioni per arrestare la digestione (concentrazione finale di 0,5% TFA).
8. Asciugare completamente i campioni utilizzando un concentratore sottovuoto. Quindi, riempire i campioni fino a un volume finale definito con TFA allo 0,1%. I campioni NMG sono stati riempiti fino a 20 μl, di cui 5 μl sono stati utilizzati per un esperimento di spettrometria di massa (MS).
9. Conservare i campioni a -80 °C fino a nuovo utilizzo. Determinare la concentrazione di peptidi mediante analisi degli amminoacidi o un altro metodo di quantificazione adatto (ad es. Direct Detect).
NOTA: Basse quantità di campioni potrebbero non essere quantificabili utilizzando le tecniche menzionate. Per garantire un caricamento identico del campione, ogni campione deve contenere la stessa quantità di tessuto isolato e ogni campione deve essere trattato allo stesso modo.
2. Cromatografia liquida ad alte prestazioni e spettrometria di massa
NOTA: Le seguenti analisi di spettrometria di massa (MS) per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) sono ottimizzate per lo specifico sistema LC con un dispositivo a colonna di intrappolamento e uno spettrometro di massa utilizzati qui (vedi Tabella dei materiali). Per altri sistemi LC e MS, si consiglia l'adattamento dei parametri.
- Utilizzando il software Xcalibur, regola le impostazioni HPLC come segue.
- Colonna trappola: Imposta la temperatura a 60 °C, la portata a 30 μL/min, il tampone funzionante allo 0,1% di acido trifluoroacetico.
- Colonna analitica C18 a fase inversa: Imposta la temperatura a 60 °C, la velocità di flusso a 30 μL/min, il tampone A allo 0,1% di acido trifluoroacetico, il tampone B all'84% di acetonitrile e il gradiente al 5%-30% del buffer B per 98 minuti.
NOTA: L'adattamento del gradiente può essere inevitabile ed è fortemente raccomandato quando si utilizzano tessuti o cellule diverse. Il tempo totale del gradiente può variare a causa del caricamento del campione all'inizio del gradiente e del lavaggio del campione alla fine del gradiente. Il gradiente totale in questo protocollo consiste in un caricamento del campione di 7 minuti e in un lavaggio aggiuntivo della colonna per 15 minuti, per un tempo di gradiente totale di 120 minuti.
- Crea un metodo di acquisizione dipendente dai dati (DDA) utilizzando il Setup dello strumento XCalibur, che puoi trovare nel menu della roadmap del software HPLC.
- Nella scheda Parametri globali, definisci la modalità di infusione Cromatografia liquida, l'ampiezza di picco LC prevista (30 s) e lo stato di carica predefinito (2).
- Procedi alla scheda Parametri di scansione e aggiungi le seguenti scansioni e filtri nell'ordine indicato: MS OT, MIPS, Intensità, Stato di carica, Esclusione dinamica e ddMS2 OT HCD.
Le impostazioni ottimali di MS e DDA potrebbero variare per lo specifico spettrometro di massa utilizzato così come per il tipo di campione e dovrebbero quindi essere adattate. - Prepara i campioni sciogliendo 200-400 ng di peptidi campione in un volume definito di 0,1% TFA in ingressi di fiale di vetro per spettrometria di massa inerte. Se la determinazione della concentrazione non è applicabile a causa della bassa quantità di campione, verificare lo stesso carico di campione confrontando la corrente ionica totale (TIC).
NOTA: Per fare ciò, apri il file risultante della misurazione spettrometrica di massa in un software adatto, ad esempio FreeStyle, e controlla il cromatogramma. Le intensità devono essere comparabili per tutti i campioni. Un TIC rappresentativo è mostrato nella Figura 1. - Analizza i dati grezzi ottenuti utilizzando un software adatto alla proteomica, ad esempio MaxQuant, Progenesis QI for Proteomics o Proteome Discoverer, ed esegui un'analisi statistica dei dati basata sulla domanda di ricerca.
3. Analisi dei dati grezzi proteomici utilizzando MaxQuant
- Carica i file grezzi nel software MaxQuant nell'intestazione dei dati grezzi facendo clic su Carica.
- Assegna i nomi dei campioni cliccando su Imposta esperimento.
- Definisci parametri specifici per il gruppo. Innanzitutto, aggiungi le modifiche. A causa dell'elaborazione del campione, scegliere Deamidazione (NQ), Ossidazione (M) e Carbamidometilazione (N-termine) come modifiche variabili e aggiungere Carbamidometilazione (C) come modifica fissa.
- Scegli la tripsina come enzima di digestione nella scheda Digestione.
- Aggiungi l'opzione di quantificazione senza etichetta LFQ nella scheda Quantificazione senza etichette. Se devono essere elaborati più di 10 file, scegliere l'opzione LFQ veloce per ridurre il tempo di elaborazione. Aggiungere l'opzione iBAQ come misura per la quantificazione delle proteine.
- Assicurati che tutti gli altri parametri specifici del gruppo rimangano nelle impostazioni di fabbrica.
- Procedi alla scheda Parametri globali e aggiungi il file FASTA derivato da uniprot.org nella scheda Sequenze. Modifica la regola dell'identificatore di conseguenza e aggiungi l'ID della tassonomia, in questo caso, 9606 per l'homo sapiens.
- Per la quantificazione delle proteine scegli i peptidi Unique e Razor.
- Assicurati che tutti gli altri parametri globali rimangano nelle impostazioni di fabbrica.
- Clicca su Start e recupera l'output proteingroups.txt dopo l'analisi di MaxQuant per ulteriori analisi in Perseus.
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Risultati
Figura 1: Corrente ionica totale (TIC) di una misurazione DDA di 120 minuti. Il cromatogramma mostra l'abbondanza relativa degli ioni corrispondenti ai peptidi elu...
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | < |
| Merck | 1.00029.2500 | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141< | |
| Acido formico | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | < |
| Carl Zeiss | 415190-9221-000 | ||
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| Acido trifluoroacetico | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company< | ||
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | < |
| Zeiss | 4.6 pro | ||
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
