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1. Generazione di sferoidi tumorali di dimensioni riproducibili
- Raccogliere le neurosfere (NS) mutanti H3K27M-mutante del glioma diffuso della linea mediana (DMG) e centrifugare a 170 x g per 10 minuti (min) a temperatura ambiente (RT).
- Per rompere l'NS, incubare 500 μL della soluzione di accutasi per 3 minuti a 37 °C.
- Neutralizzare la soluzione di accutasi con un terreno di cellule staminali tumorali (TSM)7 e centrifugare la sospensione cellulare a 355 x g per 5 min a RT.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno TSM e quindi collegare le cellule utilizzando una camera di conteggio delle cellule.
- Diluire la sospensione cellulare per ottenere 2,5-5 x 103 cellule/mL e seminare 100 μL/pozzetto in piastre a fondo tondo a 96 pozzetti con attacco ultra-basso (ULA) (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare una densità cellulare adeguata per ottenere NS individuali di ~300 μm di diametro, 4 giorni dopo la semina cellulare (250-500 cellule/pozzetto per cellule di glioma altamente aggressive).
- Confermare visivamente la formazione di NS utilizzando un microscopio invertito 4 giorni dopo la semina cellulare.
2. Preparazione del complesso reagente di marcatura degli anticorpi (ALR)/anticorpo e configurazione per il test di migrazione
- Considerare il numero di pozzetti da analizzare e calcolare il volume necessario per ciascun reagente. Includere anche i pozzetti necessari per i controlli negativi. Controllare visivamente l'NS utilizzando un microscopio invertito prima di iniziare.
- Utilizzare piastre a fondo piatto da 96 pozzetti. Eseguire il rivestimento. Per questo studio, la matrice della membrana basale (BMM) viene utilizzata come rivestimento sottile.
- Una volta che il rivestimento è pronto, rimuovere il rivestimento BMM in eccesso con una punta p200, posizionando la punta sul bordo del pozzetto ed evitando di toccare il fondo. Se si lavora con più pozzetti, utilizzare una pipetta multicanale.
- Tagliare un puntale p200, prelevare 50 μL del terreno cellulare + NS da ciascun pozzetto selezionato e trasferirlo in un pozzetto a fondo piatto rivestito. Verificare visivamente la presenza e la posizione del NS in ogni pozzo.
NOTA: Ogni NS deve essere situato centralmente nel pozzo. Evitare di appoggiarsi alla punta sul bordo del pozzetto durante il trasferimento, ma far cadere il terreno centralmente nel pozzetto senza toccare il fondo. Per le cellule altamente migratorie, considerare un numero maggiore di repliche rispetto alle tre repliche standard. Questo perché quando NS si trova troppo vicino al bordo del pozzo, le cellule in migrazione possono coprire un'area più piccola del pozzo. - Aggiungere 100 μL di acqua sterile all'ALR per reidratare il reagente (concentrazione finale = 0,5 mg/mL). Pipetta per miscelare la soluzione. NOTA: Il reagente è sensibile alla luce; Pertanto, tieniti all'oscuro. Aliquotare il reagente rimanente e conservare a -80 °C (evitare il congelamento e lo scongelamento).
- Miscelare l'anticorpo con ALR nell'apposito terreno di coltura cellulare completo in una piastra a più pozzetti a fondo rotondo o in una provetta ambrata e proteggere dalla luce. Preparare una quantità sufficiente per erogare 50 μL/pozzetto a una concentrazione del saggio 3x finale. Incubare a RT per 15 min.
- Diluire il reagente soppressore di fondo (BSR) in terreno TSM (o terreno di crescita cellulare appropriato per la linea cellulare scelta) a 1,5 mM (3x) per ottenere alla fine del saggio una concentrazione finale di 0,5 mM.
NOTA: Il reagente è sensibile alla luce. Vedere sopra per le buone procedure di gestione. - Aggiungere delicatamente 50 μl di BSR a ciascun pozzetto.
- Aggiungere delicatamente 50 μl di ALR/anticorpo a ciascun pozzetto. Attendere 2 o 3 minuti per far miscelare i reagenti e controllare visivamente utilizzando un microscopio invertito per assicurarsi che la maggior parte delle NS replicate siano posizionate centralmente nel pozzetto.
- Evitare la formazione di bolle e rimuovere quelle esistenti utilizzando un ago. Trasferire delicatamente la piastra nello strumento di analisi delle cellule vive posizionato all'interno dell'incubatore a 37 °C, 5% di CO2, 95% di umidità.
3. Impostazione dello strumento di analisi delle cellule vive per l'acquisizione delle immagini
- Scansione delle piastre utilizzando lo strumento di analisi delle cellule vive (per le specifiche, vedere Tabella dei materiali) con intervalli di scansione a partire dal punto zero (t0) dei saggi di invasione e migrazione impostati, rispettivamente, dopo il passaggio 2.14. e 3.10. fino a 96 h.
NOTA: Assicurarsi di essere in grado di smaltire lo strumento di analisi delle cellule vive immediatamente dopo l'inizio del test di invasione e migrazione. A seconda del tipo di tumore, le cellule possono iniziare a invadere o migrare dal NS già entro 1 ora dalla configurazione del test. - Sul software dello strumento di analisi delle cellule vive, selezionare l'opzione Pianifica l'acquisizione. Fare clic sulla scheda + e selezionare l'opzione Scansione pianificata.
- Nella finestra del software Crea o ripristina imbarcazione, fare clic sull'opzione Nuovo.
- Selezionare l'applicazione specifica nello strumento di analisi di cellule vive per l'acquisizione dell'invasione e della migrazione. Selezionare Sferoide tipo di scansione, obiettivo 4x, Fase+Campo chiaro e Verde per il test di invasione. Selezionare Diluizione Clonazione tipo di scansione, obiettivo 4x e Fase e Verde per il test di migrazione.
- Selezionare il tipo di piastra e definire i pozzetti da scansionare evidenziandoli sulla mappa della piastra.
- Impostare la frequenza di scansione (per gli esperimenti in questo protocollo la frequenza di scansione era di 15 minuti per l'invasione e 30 minuti per la migrazione).
- Clicca su Aggiungi alla pianificazione e avvia la scansione.