Caratterizzazione degli sferoidi del tumore neuroendocrino dell'intestino tenue mediante immunofluorescenza

Abstract

Fonte: Ear, P. H., et. al. Istituzione e caratterizzazione degli sferoidi del tumore neuroendocrino dell'intestino tenue. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la colorazione in immunofluorescenza degli sferoidi dei tumori neuroendocrini dell'intestino tenue. Gli sferoidi vengono fissati, permeabilizzati e bloccati e vengono quindi incubati con anticorpi primari e secondari. Un colorante viene aggiunto ai nuclei colorati prima di montarli e visualizzarli al microscopio a fluorescenza.

Protocollo

1. Raccolta del tumore neuroendocrino dell'intestino tenue (SBNET) e dissociazione

1. cellulareOttieni campioni SBNET di pazienti resecati dopo la conferma del tessuto tumorale dal Surgical Pathology Core.
2. Taglia gli SBNET in cubi da 5 mm e conservali in 25 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 medium in una provetta conica per il trasporto in laboratorio.
3. Trasferisci i tumori a DMEM contenenti l'1% di siero fetale bovino o FBS, l'1% di penicillina/streptomicina (Pen/Strep) e l'1% di glutammina (Wash Medium), e incuba in questo Wash Medium per 15 minuti.
4. Trasferisci i tumori in un nuovo piatto e tritali in pezzi di meno di 1 mm di diametro usando forbici curve sterili.
5. Trasferisci i tessuti tritati in una nuova provetta da 50 ml contenente 25 ml di Wash Medium.
6. Centrifuga il campione a 500 x g per 15 min a 4 °C.
7. Scartare il surnatante e risospendere i pellet in 10 ml di Wash Medium contenente collagenasi (100 U/mL) e DNasi (0.1 mg/mL).
8. Consenti che i tumori tritati vengano digeriti in un incubatore a 37 °C con agitazione lenta (50 rpm) per 1,5 h.

2. Coltura di SBNET come sferoidi tumorali in matrice extracellulare (ECM)

1. Dopo aver completato la digestione (passaggio 1.8), centrifugare a 500 x g per 15 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 15 mL di terreno di lavaggio.
2. Posiziona un filtro cellulare da 70 μm sopra una nuova provetta da 50 ml e trasferisci 10 ml del Wash Medium sopra il filtro cellulare. Agitare il mezzo di lavaggio per coprire il lato del tubo di plastica per evitare che le cellule NET si attacchino al lato del tubo di plastica.
3. Filtra la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare.
4. Centrifugare a 500 x g per 15 min a 4 °C, scartare il surnatante, risospendere il pellet in 200 μL di Wash Medium (il volume totale è ~ 250 μL), e metterlo sul ghiaccio.
5. Trasferisci 5 μL di cellule a 500 μL di Wash Medium (fattore di diluizione 1/100). Utilizzare le cellule diluite per il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro per ottenere il numero di cellule per millilitro. Moltiplicare per 100 per correggere il fattore di diluizione.
6. Moltiplica il numero di cellule per mL ottenuto nel passaggio 2.5 per il volume totale di cellule in sospensione ottenuto nel passaggio 2.4 (~ 250 μL).
7. Centrifugare a 500 x g per 15 min a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere le cellule in ECM liquida (1 x 10⁶ cellule/mL), e mantenere in ghiaccio.
8. Trasferisci 5-20 μL di sferoidi SBNET in ECM su una piastra da 96 pozzetti e lascia che l'ECM liquido si solidifichi posizionando la piastra in un incubatore a 37 °C per 5 minuti.
9. Aggiungi 200 μL di terreno di coltura SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutammina + 10 mM nicotinamide + 10 μg/mL di insulina) a ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti contenente gli sferoidi SBNET in ECM.
10. In alternativa, coltiva organoidi SBNET in terreni di cellule staminali simili a quelli precedentemente descritti per la coltivazione di organoidi di fegato umano o pancreatici ed elencati nella Tabella dei Materiali.
11. Cambia media ogni 5-7 giorni.

3. Caratterizzazione degli sferoidi SBNETS mediante immunofluorescenza

1. Trasferisci gli organoidi cresciuti in ECM in una provetta da 1,5 ml utilizzando una pipetta P1000.
2. Centrifugare a 1.500 x g per 1 minuto e rimuovere il surnatante.
3. Lava la coltura dell'organoide aggiungendo 1 mL di soluzione salina tampone fosfato o PBS, mescola, centrifuga a 1.500 x g per 1 min e rimuovi il surnatante.
4. Fissa gli organoidi aggiungendo 500 μL di paraformaldeide al 4% e incuba per 15 min.
5. Lava la coltura due volte con 1 ml di PBS.
6. Permeabilizza la coltura aggiungendo 500 μL di PBS + 3% di albumina sierica bovina o BSA + 0,1% Triton X 100 per 5 min.
7. Quindi, lava tre volte con 1 ml di PBS + 3% BSA.
8. Incubare per 1 ora con anticorpi primari contro la sinaptofisina (SYP) a 1/600 di diluizione o cromogranina A (CgA) e recettore della somatostatina 2 (SSTR2) a 1/400 di diluizione in tampone anticorpale (2,5% di albumina sierica bovina, 0,1% di sodio azide, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM di cloruro di sodio).
   NOTA: Usa 300 μL o più di soluzione anticorpale per provetta.
9. Lava tre volte con 1 ml di PBS + 3% BSA.
10. Incubare con anticorpi secondari accoppiati a FITC a 1/500 di diluizione in tampone anticorpale per 1 ora. Utilizzare 300 μL o più di soluzione anticorpale per provetta.
11. Lavare 3 volte con 1 ml di PBS + 3% BSA. Assicurati di aspirare e scartare tutto il surnatante.
12. Aggiungi 5 μL di terreno di montaggio contenente il DAPI per la colorazione nucleare.
13. Usa una pipetta P20 per trasferire 5 μL di sferoidi SBNET dal passaggio 4.12 a un vetrino e sigillare con un vetrino.
14. Scatta immagini utilizzando un microscopio fluorescente utilizzando gli obiettivi 10x, 20x o 40x.

Materiali