Misurazione del tasso di consumo di ossigeno in fette di cervello di topo acuto

Abstract

Fonte: Zhi, L. et al., Misurazione del tasso di consumo di ossigeno in fette striatali acute da topi adulti. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra come misurare il tasso di consumo di ossigeno mitocondriale (OCR) in fette di cervello striatale di topo. Descrive in dettaglio i passaggi per preparare la piastra di tessuto e la cartuccia del sensore, caricarli nell'analizzatore di flusso e spiega i processi cellulari alla base dei modelli OCR.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Idratare i sensori a cartuccia (1 giorno prima del test)

1. Aprire il kit del saggio del flusso extracellulare (vedere Tabella dei materiali) e rimuovere sia la cartuccia del sensore (verde) che la piastra di servizio (trasparente; Figura 1A). Mettere da parte la cartuccia del sensore (sensori rivolti verso l'alto) e non toccare i sensori.
2. Aggiungere 600 μl di soluzione calibrante (pH 7,4) a ciascun pozzetto della piastra di servizio. Posizionare la cartuccia del sensore sopra la piastra di servizio e immergere i sensori nella soluzione di calibrazione. Assicurarsi che la tacca triangolare dell'utilità e la piastra della cartuccia del sensore siano allineate correttamente (Figura 1B).
3. Sigillare il kit del saggio del flusso extracellulare con una pellicola sigillante per evitare l'evaporazione della soluzione calibrante, quindi collocarlo in un incubatore a 37 °C non integrato con CO₂ o ossigeno per una notte.

2. Preparare la piastra di tessuto (il giorno del saggio)

1. Aprire la micropiastra di cattura delle isole ed estrarre la piastra delle isole per la seduta dei tessuti.
2. Riscaldare un volume appropriato (625 μL per pozzetto) di liquido cerebrospinale artificiale modificato preossigenato (ACSF, composizione 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 25 mM di glucosio, 10 mM HEPES, pH 7,2) a 37 °C in una provetta da 50 mL. Quindi aggiungere BSA a una concentrazione finale di 4 mg/mL per preparare il tampone respiratorio. In generale, 50 ml sono sufficienti per una piastra.
3. Aggiungere con cautela 625 μl di tampone respiratorio (tampone ACSF preossigenato con 25 mM di glucosio e 4 mg/mL di BSA) in ciascun pozzetto della piastra dell'isolotto ed evitare di agitare la piastra. Assicurarsi che non vi siano gocce residue sulla parte superiore della cartuccia del sensore e che non siano presenti bolle d'aria nel tampone di ciascun pozzetto.

3. Preparazione della fetta striatale acuta e posizionamento della fetta asportata

1. Decapitare il topo dopo la lussazione cervicale e sezionare immediatamente il cervello in 10 mL di soluzione di taglio preossigenata ghiacciata (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 3,7 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM di glucosio, pH 7,4).
2. Sezione di fette striatali coronali con un vibratomo seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali) a uno spessore di 150 μm in soluzione di taglio ghiacciata e pre-ossigenata.
3. Recuperare le fette in 50 mL di ACSF ossigenato (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM di glucosio, 2 mM HEPES, pH 7,4) e conservare in soluzione per un massimo di 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
4. Dopo il recupero, trasferire le fette in una piastra di Petri da 35 mm x 10 mm con 5 ml di tampone per la respirazione.
5. Utilizzare un punzone per biopsia in acciaio inossidabile (ad es. 1,5 mm di diametro) per creare un pezzo di tessuto circolare nell'area desiderata del cervello affettato. Tenere la fetta nel tampone premendo delicatamente con il punzone. Assicurati che il punzone sia premuto verso il basso abbastanza forte da tagliare il tessuto. Rimuovere il resto del tessuto, sollevare il punzone e rimuovere il pezzo di tessuto circolare nel tampone.
6. Tagliare l'estremità di un puntale per pipetta da 1 ml per praticare un foro con un diametro di 1,5-2,0 mm e utilizzarlo per trattenere e trasferire la fetta perforata nella parte superiore della schermata di acquisizione. Aspirare un pezzo di tessuto cerebrale perforato e posizionare con cura il tessuto sul lato mesh dello schermo di cattura (Figura 2A). La schermata di acquisizione sarà un pezzo di plastica circolare con la rete attaccata su un lato.
   NOTA: Le schermate di cattura sono incluse nel pacchetto di micropiastre (vedi Tabella dei materiali).
7. Utilizzare delicatamente un fazzoletto di carta per asciugare brevemente lo schermo di acquisizione. Con l'umidità rimossa, il tessuto diventa appiccicoso, il che consente alla fetta di attaccarsi al centro della rete. Non asciugare troppo la fetta, altrimenti si danneggerà.
8. Tenere la fetta dello schermo di cattura con le pinzette e posizionarla in uno dei pozzetti della piastra dell'isolotto in incubazione (Figura 2B). Fare attenzione a non far cadere la fetta; In tal caso, estrarre lo schermo e posizionarvi sopra una nuova fetta.
   NOTA: Non posizionare fette di cervello nei due pozzetti di correzione dello sfondo (A1 e D6) nella piastra dell'isola.
9. Incubare la piastra dell'isolotto a 37 °C in un incubatore per almeno 30 minuti per consentire l'equilibrio della temperatura e del pH prima di eseguire il saggio.

4. Caricamento delle cartucce con i composti desiderati

1. Diluire i composti desiderati in ACSF modificato (37 °C) fino alla concentrazione madre finale di 10x, 11x, 12x e 13x della concentrazione di lavoro per le porte da A a D, rispettivamente, e regolare a pH 7,4. Il test somministrerà i composti in ordine dalla porta A alla porta D. Per questo esperimento, sono state utilizzate le seguenti soluzioni, con la rispettiva concentrazione di lavoro menzionata prima di esse: 10 mM di piruvato (porta A), 20 μM di oligomicina (porta B), 10 μM o altre concentrazioni di cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) (porta C) e 20 μM di antimicina A (porta D).
2. Precaricare delicatamente 75 μl di composti diluiti nelle porte di iniezione appropriate della cartuccia del sensore. Posizionare le punte a metà nelle porte di iniezione con un angolo di 45° con la punta contro la parete della porta di iniezione. Le punte non devono essere inserite completamente nella parte inferiore delle porte di iniezione in quanto ciò potrebbe causare perdite di composto attraverso la porta.
3. Estrarre con cura le punte dalle porte per evitare di creare bolle d'aria. Non picchiettare alcuna parte della cartuccia per evitare di alleviare le bolle d'aria.
4. Ispezionare visivamente le porte di iniezione per verificare che il carico sia uniforme. Assicurarsi che tutto il liquido sia nella porta e che non siano presenti gocce residue sulla parte superiore della cartuccia.
5. Posizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di servizio e metterla in un'incubatrice (non CO₂) per 30 minuti per consentirne il riscaldamento fino a 37 °C. Maneggiare con cura tenendosi solo alla piastra di servizio. Muoviti il meno possibile.

5. Calibrazione ed esecuzione del saggio

1. Caricare il modello di analisi nel software. Premere il pulsante verde START .
2. Assicurati di caricare il protocollo corretto. Il protocollo contiene una combinazione di sequenze di miscelazione di 3 minuti, 3 minuti di attesa e sequenze di misura di 2 minuti (questi tre passaggi formano una misurazione). Modificare la distanza della testa della sonda da 26.600 a 27.800 nelle impostazioni hardware in Impostazioni strumento. Non è necessario sostituire la testa della sonda per l'analizzatore XFe24. Premere START.
3. Caricare la cartuccia del sensore sulla piastra di servizio nel vassoio dello strumento. La tacca va nell'angolo anteriore sinistro. Assicurarsi che la piastra sia posizionata correttamente e sia piatta. Caricare la cartuccia del sensore riempita di farmaco nell'analizzatore per la calibrazione.
4. Seguire le istruzioni sullo schermo per calibrare ed equilibrare i sensori. Questa operazione richiede circa 30 minuti.
5. Una volta terminata la fase di calibrazione, rimuovere la piastra di calibrazione e sostituirla con la piastra dell'isolotto (contenente la rete e le fette di tessuto).
6. Misurare il consumo di ossigeno in ciascun pozzetto della piastra utilizzando i protocolli di analisi. Il protocollo contiene una combinazione di 3 minuti di miscelazione, 3 minuti di attesa e 2 minuti di sequenze di misurazione (questi tre passaggi formano una misurazione), a quel punto viene calcolato il tasso di consumo di ossigeno (OCR).
7. Per l'intero esperimento, includere 4 misurazioni OCR per creare una linea di base, seguite dall'iniezione della porta A (piruvato) con 4 misurazioni, quindi l'iniezione della porta B (oligomicina) con 8 misurazioni, quindi l'iniezione della porta C (FCCP) con 5 misurazioni e, infine, l'iniezione della porta D (antimicina A) con 6 misurazioni.
   NOTA: Questo numero di misurazioni dopo ogni iniezione di composto è determinato a seconda di quando la misurazione raggiunge il plateau.
8. Analizza i dati di misurazione OCR e i dati sull'efficienza dell'accoppiamento.

Risultati

Figura 1: Immagini che mostrano i sensori e la piastra della cartuccia dell'analizzatore di flusso extracellulare. (A) La cartuccia del sensore che si trova sopra una piastra di calibrazione (piastra di servizio). (B) Vi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti Accumet AB150 Misuratore da banco pHThermo Fisher Scientific13-636-AB150Per misurare pHAntimicina A da Streptomyces sp.SIGMAA8674Per inibire il complesso III dei mitocondriAlbumina sierica bovina (BSA)SIGMAA6003Per fare il liquido cerebrospinale artificiale modificato (BSA-ACSF)Cianuro di carbonile 4-( trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP)SIGMAC2920Per disaccoppiare la respirazione mitocondriale<tr style='height:19px;'>D-GlucosioSIGMAG8270Per creare liquido cerebrospinale artificiale (ACSF)DMSOSIGMAD8418Per dissovle compostiHEPESSIGMAH3375Per creare liquido cerebrospinale artificiale (ACSF)Incubatore umidificato senza anidride carbonicaFisher Scientific11-683-230DPer idratare le piastre a 37 °COligomicina da Streptomyces diastatochromogenesSIGMAO4876Per inibire l'ATP sintasi mitocondrialeParafilmSIGMA-ALDRICH sealing filmSeahorse XF Calibrant Solution 500 mLCavalluccio Marino103681-100Soluzione per la calibrazione del cavalluccio marinoAnalizzatore di Flusso Extracellulare XF Cavalluccio MarinoSeahorse Bioscience Attrezzatura utilizzata per analizzare il tasso di consumo di ossigeno, vecchia generazioneCavalluccio marino XFe24 Analizzatore di flusso extracellulareSeahorse Bioscience Attrezzatura utilizzata per analizzare il tasso di consumo di ossigeno, nuova generazioneCavalluccio marino XF24 FluxPaksSeahorse Bioscience<td style='overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>101174-100Pacchetto di cartucce per sensori analizzatore di flusso, piastre per colture tissutali, schermi di cattura, soluzione calibrante e piastre di calibrazione; kit di analisi.Sodium pyruvate<td style='overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>SIGMAP2256Per evitare qualsiasi vincolo limitante del substrato di fornitura del substratoPunzoni per biopsia in acciaio inossidabileMiltex Dispositivo utilizzato per perforare le fettePiatto sterile per colture cellulari, 35 x 10 mmEppendrof30700102Utilizzato per slice punchVibratomeLeicaVT1200Per affettare il tessuto cerebraleBagno d'acquaThermo Scientific Precision282-115Per riscaldare il tampone e le soluzioni