Sviluppo di un modello sperimentale di aneurisma in un coniglio utilizzando una sacca vascolare trattata con elastasi

Abstract

Fonte: Wanderer, S., et al. Modello di aneurisma della biforcazione microchirurgica della sacca arteriosa nel coniglio. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra la creazione di un modello sperimentale di aneurisma in un coniglio utilizzando una sacca vascolare trattata con elastasi. Dopo aver asportato un segmento del CCA destro, la sacca viene trattata con elastasi, quindi suturata al CCA sinistro per ripristinare il flusso sanguigno. Lo stress risultante sulle pareti indebolite della sacca induce la formazione di aneurisma.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono i modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

NOTA: Alloggiare tutti gli animali a una temperatura ambiente di 22\u2224 gradi Celsius (°C) e mantenere un ciclo luce/buio di 12 ore (h). Fornire ogni volta l'accesso gratuito all'acqua, al pellet e alla dieta a base di fieno ad libitum. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il test non parametrico di Wilcoxon-Mann-Whitney-U. Un valore di probabilità (p) di ≤ 0,05 è stato considerato significativo.

1. Fase preoperatoria

1. Eseguire un esame clinico preoperatorio dettagliato di tutti i conigli pianificati per l'intervento chirurgico immediatamente accanto a una sala operatoria silenziosa e asettica, mantenendo una temperatura di 23 ± 3 °C.
   1. Registrare macroscopicamente il peso di ciascun animale e valutare le mucose, tempo di ricarica capillare e qualità del polso.
   2. Successivamente, eseguire l'auscultazione cardiaca con stetoscopio e la palpazione addominale.
   3. Sulla base dei risultati clinici, attribuire una classificazione dell'American Society of Anesthesiologists (ASA) a ciascun coniglio19. Includi nello studio solo gli animali con un punteggio ASA I.
   4. Radere entrambe le orecchie esterne con un rasoio elettrico e applicare una crema alla prilocaina-lidocaina sia sulle arterie auricolari che sulle vene.
2. Sedare il coniglio con una combinazione di 20 milligrammi (mg)/chilogrammo (kg) di ketamina, 100 mg/kg di dexmedetomidina e 0,3 mg/kg di metadone iniettato per via sottocutanea (SC) tramite una siringa.
3. Lasciare ogni animale indisturbato per almeno 15 minuti.
4. Dopodiché, sotto ossigenazione supplementare con 3 litri (l) /minuto (min) attraverso una maschera facciale allentata e un monitoraggio costante attraverso un pulsossimetro, posizionare una cannula da 22 G nell'arteria centrale auricolare sinistra e un'altra cannula da 22 G nella vena auricolare dell'orecchio controlaterale.
5. Radere il campo chirurgico (collo) e iniettare lo 0,75% di ropivacaina peri-incisionale per via intradermica. Successivamente, radersi la fronte e prepararsi a posizionare i sensori elettroencefalografici (EEG) pediatrici.
6. Indurre l'anestesia generale con propofol 1-2 mg/kg per via endovenosa (IV) per effetto. Quindi, intubare immediatamente la trachea di tutti i conigli con un tubo di silicone (3 millimetri (mm) di diametro interno) sotto controllo capnografico. Successivamente, trasporta tutti i conigli in sala operatoria, mettili in decubito dorsale e collega il tubo a un sistema circolare pediatrico.
7. Ottenere l'approfondimento e il mantenimento dell'anestesia attraverso l'isoflurano nell'ossigeno, mirando a una concentrazione massima di isoflurano di fine espirazione dell'1,3%.
8. Garantire il monitoraggio clinico e strumentale (pulsossimetria, doppler e pressione arteriosa invasiva, elettrocardiogramma a 3 derivazioni, EEG, monitoraggio della temperatura rettale e gas inalati ed espirati) fino all'estubazione tracheale.
9. Per mantenere l'idratazione, il lattato di Ringer viene fornito in infusione continua (CRI) di 5 ml/kg/h attraverso l'accesso venoso. Confermare sempre la corretta anestesia utilizzando pizzichi per le dita dei piedi a un intervallo di 10 minuti.
10. Disinfettare il campo chirurgico utilizzando lo iodio povidone dal manubrio-sterno a entrambi gli angoli della mascella. Ora, eseguire il drappeggio sterile del campo chirurgico.
11. Durante l'intervento chirurgico, fornire analgesia con lidocaina a un CRI di 50 microgrammi (μg)/kg/min e fentanil a 3\u201210 μg/kg/h. Applicare la ventilazione spontanea o assistita e l'ipercapnia permissiva. Eseguire l'emogasanalisi arteriosa almeno una volta durante l'intervento chirurgico.
12. Trattare l'ipotensione rilevante (pressione arteriosa media < 60 mmHg) con noradrenalina. Prevenire l'ipotermia (temperatura rettale ≤ 38 °C) utilizzando un termoforo o un sistema di riscaldamento ad aria forzata.

2. Fase chirurgica – Fase I

1. Iniziare l'intervento chirurgico con un'incisione cutanea mediana dal manubrio sterno al livello degli angoli della mascella/laringe. Seziona bruscamente la pelle e i tessuti molli con un bisturi, forbici chirurgiche e pinze. Separare il sottocute e il cuscinetto adiposo medialmente mediante dissezione smussata.
2. Entrare nella cresta superiore anteriore del muscolo sternocleidomastoideo medialmente sul lato sinistro mediante dissezione smussata utilizzando micro pinze e forbici chirurgiche.
3. Macroscopicamente, eseguire la preparazione smussata e separare accuratamente il CCA sinistro dal nervo vagale distalmente per evitare la paresi laringea utilizzando ulteriormente micro pinze e forbici chirurgiche (Figura 1). Si noti che la biforcazione del CCA sinistro funge da punto di riferimento intraoperatorio (Figura 2 e Figura 3A). Per tutti i passaggi successivi, utilizzare un divaricatore di tessuti molli per migliorare la visualizzazione chirurgica.
4. Dopo aver preparato con successo e liberato il CCA distale sinistro dal nervo vagale, somministrare localmente papaverina (40 mg/ml, 1:1 diluito in soluzione isotonica di cloruro di sodio allo 0,9%) localmente. Proteggere continuamente tutti i segmenti dei vasi con micro tamponi seguiti da un'ulteriore somministrazione di papaverina all'esterno. Posizionare il CCA sinistro imbevuto di papaverina sotto il tessuto muscolare autologo per proteggere il vaso dall'essiccazione sotto la luce del microscopio operatorio.
5. Cambia lato massimizzando il comfort del chirurgo durante la procedura operatoria. Ripetere la stessa procedura chirurgica sul lato destro. Sezionare il CCA distalmente e prossimalmente fino ai punti di riferimento predefiniti (biforcazione carotidea a livello degli angoli mascellari/laringe e vena giugulare interna; Figura 3A,B). Reinserire uno spandiconcime e somministrare micro tamponi e papaverina come descritto in precedenza.
6. Prima della legatura del CCA prossimale destro, iniettare eparina (500 unità internazionali (UI)/kg) per via sistemica tramite un catetere auricolare venoso.
7. D'ora in poi usa un microscopio operatorio. In primo luogo, legare il CCA prossimale destro con una sutura 4-0 non assorbibile direttamente alla fine del punto di riferimento prossimale macroscopicamente visibile per evitare qualsiasi tensione sul vaso arterioso.
   1. In secondo luogo, applicare una legatura 6-0 non assorbibile esattamente 4\u20125 mm distalmente utilizzando una clip per vasi per la misurazione, considerando che dopo aver tagliato distalmente dalla prima legatura 4-0, la sacca arteriosa risultante sarà di lunghezza standardizzata di circa 3\u20124 mm in ogni animale (Figura 4A,C).
8. Dopo aver stretto la legatura 6-0, bloccare il CCA destro il più distalmente possibile con una clip temporanea per vasi (come normalmente utilizzato nella chirurgia dell'aneurisma cerebrale) per evitare danni endoteliali e per creare un lungo segmento di vaso per l'irrigazione al fine di prevenire la trombogenesi (Figura 4B).
9. Ora eseguire un taglio distalmente alla legatura 4-0 non assorbibile. Per prelevare la sacca arteriosa (Figura 4C), eseguire un secondo taglio distalmente alla legatura 6-0 non assorbibile.
10. Pulire meticolosamente la sacca arteriosa da tutti i tessuti molli e misurarne la lunghezza, la larghezza e la profondità (Figura 4C) con una clip per vasi. Se non sono necessarie ulteriori modifiche, conservare l'innesto arterioso autologo in una soluzione eparinizzata (500 UI/100 ml in cloruro di sodio isotonico allo 0,9%) a temperatura ambiente fino a nuovo utilizzo.

3. Degradazione della sacca arteriosa

1. Se è necessaria una degradazione della sacca arteriosa, pulirla meticolosamente dai tessuti molli e preincubarla con 100 UI di elastasi suina disciolta in 5 ml di Tris-tampone a temperatura ambiente il giorno dell'esperimento per 20 minuti. Non utilizzare una tecnica a pennello. Incubare la sacca arteriosa intra ed extraluminalmente utilizzando uno shaker.
2. Prima di immergere la busta in una soluzione eparinizzata di cloruro di sodio isotonico allo 0,9%, passarla delicatamente tre volte per 3 minuti con una pinza anatomica in una soluzione isotonica di cloruro di sodio allo 0,9% per lavare via l'elastasi suina rimanente.
3. Se necessario, tenere aperto il lume della sacca arteriosa con un microtubo in silicone; proteggere meticolosamente il CCA sinistro e destro durante l'intera procedura chirurgica con micro imbottiture bagnate.

4. Fase chirurgica – Fase II

1. Per un'ulteriore preparazione del CCA, posizionare due micro tamponi rotondi direttamente sotto di esso per muovere l'arteria più superficialmente. Ora, metti un micro tampone con imbottitura viola sotto il CCA sinistro nel terzo distale per una migliore visualizzazione dell'arteria.
2. Sciacquare il CCA prossimale destro con una soluzione di cloruro di sodio isotonico allo 0,9% combinata con 500 UI di eparina disciolta in 100 ml di cloruro di sodio isotonico allo 0,9%. Per creare un'anastomosi senza tensione, posizionare il CCA destro sotto il cuscinetto adiposo/muscolatura peritracheale utilizzando le forbici chirurgiche per incanalarlo sul lato sinistro. Rimuovere il tessuto molle dell'arteria.
   1. Ora esegui un'incisione della bocca di pesce di 2 mm sul lato prossimale del CCA destro usando una micro forbice e una pinza.
3. Cambiare il lato del tavolo operatorio. Agganciare il CCA distale sinistro con un'altra clip temporanea del vaso seguita dalla CCA prossimale sinistra con due clip temporanee del vaso. Proteggere tutti i segmenti dei vasi esposti dall'essiccazione sotto la lampada chirurgica utilizzando micro tamponi umidi.
4. Liberare completamente il terzo distale del CCA sinistro dai tessuti molli ed eseguire un'arteriotomia. Usa le micropinze chirurgiche e afferra delicatamente alcuni tessuti molli. Ora sollevare l'arteria e incidere lentamente il CCA distale sinistro con una microforbice chirurgica. Sciacquare i segmenti del vaso con eparina (500 UI disciolte in 100 ml di soluzione isotonica di cloruro di sodio allo 0,9%).
5. Dopo aver eseguito l'arteriotomia con micro pinza curva e micro forbici, allargare distalmente l'arteriotomia situata al terzo distale del CCA sinistro, misurando circa 2 volte il diametro del contundente destro dell'arteria carotide e dell'innesto autologo. Ciò consente un flusso sanguigno sufficiente nella sacca arteriosa.
6. Estrarre la sacca arteriosa dalla soluzione salina eparinizzata. Posizionare la sacca nel campo chirurgico, dove è prevista la biforcazione. Iniziare a suturare la parte posteriore della carotide destra smussata caudalmente con una sutura 9-0 non assorbibile, seguita da una sutura sul lato posteriore situato cranialmente a livello dell'incisione della bocca del pesce. Terminare la cucitura della parte posteriore da distale a prossimale con punti singoli.
7. Durante la sutura, mantenere umide tutte le buste preincubate di elastasi con irrigazione continua. Durante la sutura della parete del vaso della sacca, utilizzare micro pinze chirurgiche curve per aprire delicatamente il lume con la punta. Ogni volta che si suturano parti del CCA sinistro o destro prossimale, utilizzare micro pinze chirurgiche diritte. Successivamente, sutura il lato posteriore orizzontale.
8. Quindi sutura il lato anteriore orizzontale, partendo dalla cupola dell'aneurisma spostandosi verso la sua base. Successivamente, inizia con punti singoli distalmente sul lato anteriore muovendoti caudalmente.
   1. Per tutti i passaggi 4.5-8 durante la sutura dell'anastomosi prestare attenzione solo ad afferrare la parte del vaso vicino all'arteriotomia per evitare la stenosi iatrogena. Inoltre, inumidire continuamente tutti i segmenti dei vasi durante l'intera procedura chirurgica in modo extraluminale con una siringa riempita con soluzione di cloruro di sodio eparinizzata (500 UI disciolti in 100 ml di cloruro di sodio isotonico allo 0,9%) e proteggerli con micro tamponi umidi.
   2. Prima di terminare l'anastomosi, irrigare l'intero complesso con una soluzione eparinizzata di cloruro di sodio isotonico allo 0,9% intraluminale (500 UI disciolte in 100 ml di cloruro di sodio isotonico allo 0,9%). Attenzione che le sacche arteriose modificate con elastasi devono essere cucite il più rapidamente possibile a causa della loro forte tendenza a seccarsi e a trombosi. A causa del comportamento aggressivo della concentrazione residua di elastasi nella sacca per quanto riguarda la digestione dei vasi circonferenziali, procedere rapidamente con l'intervento chirurgico per riperfondere rapidamente il complesso vascolare.
9. Rimuovere gradualmente tutti i morsetti vascolari temporanei.
   1. Rimuovere il morsetto distale dal CCA sinistro. Accettare il sanguinamento minore e fermarlo imprimendo delicatamente micro tamponi sull'anastomosi. Successivamente, rimuovere la pinza del CCA destro, premere delicatamente con micro tampone e pinza per evitare la formazione di trombi.
   2. Se necessario, sostituire le clip vascolari temporanee per fornire una coagulazione sufficiente. Successivamente, scaricare entrambe le clip dei vasi dal lato sinistro prossimalmente. Se necessario in qualsiasi passaggio, sostituire le clip per consentire la coagulazione o per eseguire la ricucitura.
10. In questa fase eseguire l'angiografia a fluorescenza del complesso vascolare (Figura 5)
    NOTA: L'angiografia a fluorescenza viene eseguita somministrando 1 ml di fluoresceina IV, utilizzando 2 filtri passa-banda, uno smartphone con videocamera e un riflettore per bicicletta. Questa procedura è già stata descritta altrove20,21,22.
11. Infine, chiudere la sede operativa. Riadattare e suturare delicatamente il cuscinetto adiposo con una sutura riassorbibile 3-0 a singoli nodi per proteggere l'anastomosi. Chiudi il sottocute e la pelle allo stesso modo.

5. Fase post-chirurgica

1. Interrompere la somministrazione di isoflurano e analgesia sistemica al termine dell'intervento chirurgico e fornire l'estubazione tracheale non appena il riflesso di deglutizione è tornato.
2. Somministrare 0,5 mg/kg di meloxicam IV, 10 mg/kg di aspirina (ASS) EV, 100 μg di vitamina B12 SC e 20 mg/kg di clamoxyl IV.
3. Fornire un'ossigenazione supplementare e un riscaldamento attivo fino a quando i conigli non hanno riacquistato spontaneamente la decubito sternale.
4. Eseguire il follow-up postoperatorio e la cura degli animali quattro volte al giorno per i primi tre giorni in conformità con le linee guida per la valutazione e la gestione del dolore nei roditori e nei conigli23,24.
5. Somministrare l'analgesia post-operatoria tramite un cerotto al fentanil (12 μg/h) applicato sull'orecchio esterno, meloxicam una volta al giorno SC per tre giorni e metadone come terapia di salvataggio SC, secondo il foglio di valutazione per la valutazione del dolore. Somministrare 250 UI/kg di eparina a basso peso molecolare (LMH) per via sottocutanea per tre giorni in tutti i conigli.

Risultati

Figura 1: Fase operativa iniziale.

Fase operativa iniziale, raffigurante l'arteria carotide sinistra (freccia bianca), il nervo vagale (freccia nera) (A) e l'attenta separazione dell'arteria carotide sinistra dal nervo vagale distalmente per evitare la paresi larin...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3-0 sutura riassorbibile	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 sutura non assorbibile	B. Braun, Germania	G0762563
6-0 sutura non assorbibile	B. Braun, Germania	C0766070
9-0 sutura non assorbibile	B. Braun, Germania	G1111140
Adrenaline	Amino AG	1445419	any generic
Amiodarone	Helvepharm AG	5078567	qualsiasi generico
Macchina per anestesia	Dräger		qualsiasi altra
Aspirina	Sanofi-Aventis (Suisse) SA	622693	qualsiasi generic
Atropine	Labatec Pharma SA	6577083	qualsiasi generic
Filtro passa-banda blu	Thorlabs	FD1B	qualsiasi altro
Filtro passa-banda verde	Thorlabs	FGV9	any other
Pinze bipolari			qualsiasi altro
Riflettore			qualsiasi altro
Clip per vaso Biemer (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Svizzera	FD560R	temporaneo
Indice bispettrale (neonatale)			qualsiasi altro
Bracciale per la pressione sanguigna (neonatale)			qualsiasi altro
Clamoxyl	GlaxoSmithKline AG	758808	qualsiasi generic<
Ever Pharma	136740-1	qualsiasi generico
Elettrocardiogramma elettrodi			any other
Elastase	Sigma Aldrich	45125	any generic
Ephedrine	Amino AG	1435734	qualsiasi generico
Esmolol	OrPha Swiss GmbH	3284044	qualsiasi generico
Fentanyl (uso endovenoso)	Janssen-Cilag AG	98683	any generic
Fentanyl (transdermico)	Mepha Pharma AG	4008286	qualsiasi generico
Fluoresceina	Curatis AG	5030376	qualsiasi generic
Fragmin	Pfizer PFE Switzerland GmbH	1906725	qualsiasi generic<
		any generic<
		qualsiasi altro
Soluzione isotonica di cloruro di sodio (0.9%)	Fresenius KABI	336769	qualsiasi generic
Ketamine	Pfizer	342261	qualsiasi generic<
Stuart	SRT6	qualsiasi altro
Lidocaina	Streuli Pharma AG	747466	any generic
Longuettes			any other
Metacam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Methadone	Streuli Pharma AG	1084546	qualsiasi generico
Microtubi			qualsiasi altro
Porta aghi			qualsiasi altro
Midazolam	Accord Healthcare AG	7752484	qualsiasi generic<
		qualsiasi altro
O2-Face mask			any other
Operation microscope	Wild Heerbrugg		any other
Papaverine	Bichsel		any generic
Prilocaine-lidocaine crème	Emla		any generic
Propofol	B. Braun Medical AG, Svizzera		qualsiasi generico
Pulsossimetro			qualsiasi generico
Sonda di temperatura rettale (neonatale)			qualsiasi altra
Ropivacaine	Aspen Pharma Schweiz GmbH	1882249	qualsiasi generico
Scalpell	Swann-Morton	210	qualsiasi altro
Rasoio			qualsiasi altro
Smartphone			qualsiasi altro
Pinze per tessuti molli			qualsiasi altro
Spalmatore			qualsiasi altro
Ciotole in			qualsiasi altro
Micro tamponi			qualsiasi altro
Stetoscopio			qualsiasi altro
Micro-pinze			qualsiasi altro
Micro-forbici			qualsiasi altro
Pinze			qualsiasi altro
Telo chirurgico			qualsiasi altro
Forbici			qualsiasi altro
Siringhe 1 ml, 2ml e 5 ml			qualsiasi altro
Tris-Buffer	Sigma Aldrich	93302	qualsiasi generico
Applicatore di clip vascolari	B. Braun, Germania	FT495T
Catetere venoso e arterioso 22 G			any generic
Vitarubin	Streuli Pharma AG	6847559	any generic<
B. Braun Medical AG, Aesculap, Svizzera	FT242T	Provvisorio

per bicicletta td style='altezza:14.5pt;'>Dexmedetomidinatd style='height:15.75pt;'>Glycotd style='height:15.75pt;'>Pad riscaldantetd style='height:15.75pt;'>Agitatore da laboratorio micro td style='height:15.75pt;'>Porta ago per piccoli animali di tessuti molli spugna in acciaio inossidabile sterili dritte e curve dritte e curve dritte e curve chirurgiche td style='height:15.75pt;'>Yasargil titan standard clip (2 x)