Misurazioni basate sull'impedenza dell'invasione delle cellule tumorali cerebrali

Abstract

Fonte: Mudduluru, G., et. al. Misurazione in tempo reale basata sull'impedenza della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra un test basato sull'impedenza per misurare l'invasione e la migrazione delle cellule di glioblastoma. Le cellule degradano la matrice extracellulare, si muovono attraverso le membrane microporose e aderiscono agli elettrodi, generando impedenza. Questa analisi in tempo reale riflette il loro potenziale invasivo per le applicazioni della ricerca sul cancro.

Protocollo

1. Preparazione del sistema di analisi cellulare in tempo reale, piastre di invasione e migrazione cellulare (CIM) e celle elettroporate U-118MG per la placcatura

1. Posiziona il sistema di analisi delle celle in tempo reale in un CO₂ incubatrice in condizioni di coltura 5-6 ore prima dell'inizio dell'esperimento per stabilizzare il sistema alle condizioni di coltura.
2. Per il test di invasione, piastra 50 μL di DMEM (plain medium) contenente gel di matrice extracellulare (ECM) a 0,1 μg/μL in ciascun pozzetto della camera superiore della piastra CIM. Per evitare la formazione di bolle d'aria, utilizzare il metodo di pipettaggio inverso. Rimuovere immediatamente 30 μl di gel ECM, lasciandone 20 μl nel pozzetto.
3. Dopo il rivestimento in gel ECM, conservare la piastra nell'incubatore in condizioni di coltura per 4 ore con il coperchio. Durante il rivestimento e l'asciugatura del gel ECM, adottare misure preventive per evitare il contatto diretto con gli elettrodi della camera superiore delle piastre con le mani, le superfici della cabina di biosicurezza o il CO₂ incubatrice.
4. Per impostare il programma di misurazione dell'impedenza, fai doppio clic sull'icona del software associato (vedi Table of Materials) per aprire l'applicazione software del sistema (unità di controllo). Ogni culla ha una finestra individuale con diverse schede per impostare le condizioni sperimentali, l'intervallo di tempo e la durata della misurazione dell'impedenza e l'analisi dei dati.
5. Sotto il Layout scheda, imposta pozzetti quadruplicati per ogni condizione biologica e imposta le misurazioni dell'impedenza cellulare in due fasi sotto il Schedule scheda. Il primo passo è per una misurazione di base una tantum (uno sweep con un intervallo di 1 minuto) e il secondo passo è misurare l'impedenza della cella nelle rispettive culle individuali per un esperimento vero e proprio. Per la migrazione, utilizzare 145 sweep con un intervallo di 10 minuti e per l'invasione, 577 sweep con un intervallo di 10 min, impostati individualmente) nelle rispettive culle individuali.
6. Un'ora prima dell'inizio della misurazione dell'impedenza cellulare, aggiungere 160 μl di DMEM con il 10% di FBS come chemioattrattivo ai pozzetti della camera inferiore della piastra. Assemblare la camera superiore contenente i pozzetti rivestiti di gel ECM o i pozzetti non rivestiti con la camera inferiore per misurare rispettivamente l'invasione e la migrazione.
7. Riempire i pozzetti nella camera superiore con 50 μL di terreno a basso contenuto di siero e posizionarli nella culla del sistema. Controlla se tutti i pozzetti sono riconosciuti dall'unità di controllo facendo clic sul Message scheda. Se il messaggio viene visualizzato come OK, la piastra nella culla è pronta per l'esperimento.
8. Preincubare le piastre completamente impaccate nell'incubatore in condizioni di coltura per 1 ora prima delle misurazioni nella culla del sistema di analisi cellulare in tempo reale, che è essenziale per l'acclimatazione di una piastra impaccata alle condizioni di coltura cellulare.
9. Per la raccolta di cellule trattate con un basso livello di siero, lavare le cellule che crescono in piastre di coltura con 1x PBS e aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% (acido etilendiamminotetraacetico). Mettere nell'incubatrice per 30 s e rimuovere la tripsina-EDTA. Raccogli le celle nel low serum medium in un tubo da 15 mL e conta le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato portatile.
10. Dopo il conteggio, centrifuga le celle a 100 x g per 5 min e scartare il surnatante.
11. Risospendere 800.000 cellule in 800 μL di terreno a basso contenuto di siero per i saggi di migrazione e invasione. Inoltre, risospendere 300.000 cellule in 2 mL di terreno di coltura e seminare in una piastra da 35 mm per l'analisi Western blot per confermare il knockdown regolato di Crk e CrkL.

2. Lettura di base, semina delle celle e misurazione e visualizzazione dell'impedenza delle celle

1. Misura la lettura della linea di base facendo clic sulla culla inizio. La linea di base deve essere letta dopo aver preincubato le piastre per 1 ora nella culla del sistema di analisi cellulare in tempo reale in condizioni di coltura nell'incubatore ad anidride carbonica e prima di seminare le cellule nei rispettivi pozzetti nella camera superiore.
   NOTA: Una volta la cullainizio pulsante viene cliccato, la centrale chiederà se salvare il file sperimentale. Dopo che il file è stato salvato, l'analizzatore della culla misura l'impedenza della cella di base come impostato inizialmente nel programma ed entra in modalità di pausa fino a quando la culla non Start pulsante viene cliccato di nuovo per misurare l'impedenza della cella nel secondo passaggio.
2. Estrarre entrambe le piastre per la migrazione e l'invasione dalle culle dopo la misurazione di base e conservarle nella cabina di biosicurezza.
3. Seminare 100 μL di cellule (100.000 cellule) in quadruplicate per ogni condizione biologica nella camera superiore della piastra CIM nei rispettivi pozzetti, come programmato nell'unità di controllo della culla mediante pipettaggio inverso per evitare bolle d'aria.
4. Dopo la semina, tenere la piastra sotto una cappa di biosicurezza per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire alle cellule di depositarsi uniformemente sul fondo. Trasferire nuovamente la piastra nella rispettiva base e fare clic sul pulsante di avvio della culla per iniziare a misurare l'impedenza della cella come programmato nel secondo passaggio di 1.5.
5. Dopo l'ultimo sweep, l'esperimento è terminato e i risultati vengono salvati automaticamente.
6. Sotto il Data Analysis scheda, visualizza le variazioni dell'impedenza cellulare come indice cellulare in modo dipendente dal tempo durante o dopo il completamento dell'esperimento. Ciascuna delle rispettive condizioni di quadruplicate può essere visualizzata individualmente o come medie e/o deviazioni standard facendo clic su Options
7. Per esportare i dati dell'indice delle celle in un file di foglio di calcolo, apri un file di foglio di calcolo vuoto, posiziona il cursore al centro del Data Analysis finestra e fare clic con il pulsante destro del mouse. Nella finestra di dialogo che appare, scegli l'opzione Copia i dati nel formato elenco e incolla i dati nel foglio di calcolo aperto.
8. Regolare l'ora nei dati grezzi per rappresentare l'ora di inizio effettiva della misurazione dell'impedenza della cella. L'ora di inizio del secondo passaggio è impostata su zero.
   NOTA: L'unità di controllo ha la possibilità di ottenere l'indice delle celle con o senza normalizzazione (cioè l'indice delle celle normalizzato) e di visualizzare i risultati come presentazione grafica in modo dipendente dal tempo. In questo esempio, i dati dell'indice delle celle vengono esportati senza normalizzazione per l'elaborazione e la presentazione grafica.
9. Rilascia l'esperimento facendo clic sul pulsante Release pulsante in ogni culla.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
piastre CIM	Divisione Analisi Cellulare di Agilent Technologies, Inc	5665825001	Piastre
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	302002	Terreno di coltura utilizzato per la cella culture
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS utilizzato per lavare le cellule
Siero bovino fetale (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Incubatore ad anidride carbonica Heracell VIOS 160i	ThermoFisher Scientific	51030285	Incubatore
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix gel
Software RTCA	Divisione Analisi Cellulare di Agilent Technologies, Inc		Strumento utilizzato per l'esperimento
Scepter	Millipore	C85360	Contatore
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Linee cellulari utilizzate per gli esperimenti
xCELLigence RTCA DP	Divisione Analisi Cellulare di Agilent Technologies, Inc	380601050

di invasione e migrazione cellulare ad anidride carbonica di celle automatizzato portatile