Sviluppo di un modello di pressione translaminare utilizzando un sistema autonomo translaminare

Abstract

Fonte: Sharma, T. P., et al., Modello di sistema autonomo translaminare per la modulazione della pressione intraoculare e intracranica nei segmenti posteriori di donatori umani. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra la procedura di preparazione di un occhio umano per studiare gli effetti della pressione translaminare sulla segnalazione delle cellule gangliari retiniche simulando le pressioni intraoculari e intracraniche in un sistema translaminare autonomo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Preparazione e sterilizzazione di attrezzature e forniture

1. Consulta la Tabella dei Materiali per un elenco completo delle forniture richieste, nonché i numeri di fornitore e catalogo.
2. Prima dell'uso, sterilizzare tutte le attrezzature e gli strumenti in autoclave o utilizzando fiale di ossido di etilene.

2. Preparazione del terreno

1. di perfusioneAggiungi l'1% di penicillina-streptomicina (10.000 U/mL di penicillina, 10.000 μg/mL di streptomicina in 0,85% di NaCl) e l'1% di L-glutammina (200 mM) a 1.000 mL di terreno di Eagle's modificato da Dulbecco (DMEM).
2. Sterilizza il mezzo di perfusione passando attraverso un filtro da 0,22 μm.

3. Impostazione

1. del sistema autonomo translaminare (TAS)Imposta le siringhe di afflusso (serbatoi di pressione intraoculare (IOP) e pressione intracranica (ICP)).
   1. Aggiungi 30 ml del mezzo di perfusione (sezione 2) a una siringa da 30 ml. Collegare un rubinetto a 3 vie alla siringa da 30 ml. Collegare un filtro idrofilo da 0,22 μm al rubinetto a 3 vie. Collegare un adattatore per tronchetto Luer da 15 G al filtro idrofilo da 0,22 μm.
   2. Rimuovi le bolle d'aria dalla configurazione della siringa. Collegare il tubo all'adattatore per tronchetto Luer da 15 G. Chiudere la porta laterale del rubinetto con un tappo di bloccaggio universale non ventilato. Ripetere per un totale di due configurazioni.
   3. Etichetta una siringa come pressione intracranica del canale 1 (CH1 ICP) e l'altra siringa come pressione intraoculare del canale 2 (CH2 IOP).
2. Imposta le siringhe di deflusso (serbatoi IOP e ICP).
   1. Attacca un rubinetto a 3 vie a una siringa da 30 ml. Collegare un adattatore per tronchetto Luer da 15 G al rubinetto a 3 vie. Collegare il tubo all'adattatore per tronchetto Luer da 15 G.
   2. Chiudi la porta laterale del rubinetto con un tappo di chiusura universale non ventilato. Ripetere per un totale di due configurazioni. Etichettare una siringa come CH1 ICP e l'altra siringa come CH2 IOP.

4. Preparazione dell'intero globo oculare umano

NOTA: Se vengono ricevuti occhi interi, segui la procedura seguente per separare il segmento anteriore dal segmento posteriore dell'occhio. Se gli occhi vengono ricevuti divisi in due, iniziare dal passaggio 4.4.

1. Metti un occhio intero nella soluzione di iodio povidone per 2 minuti.
2. Risciacqua l'occhio in una soluzione sterile tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere lo iodio povidone. Ripeti due volte.
3. Rimuovi gli annessi dall'intero globo oculare usando pinze e forbici. Dividere in due l'occhio all'equatore per separare i segmenti anteriore e posteriore dell'occhio.
4. Rimuovi la guaina del nervo ottico. Rimuovere l'umor vitreo dal segmento posteriore.
5. Taglia la sclera aggiuntiva dal segmento posteriore, se necessario, per garantire un buon adattamento sulla cupola rotonda della camera IOP (inferiore). Usando una pinza, assicurati che la retina sia distribuita uniformemente sulla parte posteriore del segmento.
6. IOP (inferiore) configurazione della camera
   1. Posiziona il segmento posteriore umano nella camera IOP (inferiore) del TAS sopra la cupola rotonda con il nervo ottico rivolto verso l'alto.
   2. Sigilla il segmento posteriore utilizzando l'O-ring in resina epossidica con quattro viti, garantendo una tenuta ermetica.
   3. Inserisci il tubo nelle porte IN e OUT della camera IOP (inferiore). La siringa di afflusso IOP con tubo contenente fluido viene inserita nella porta IN e la siringa di deflusso IOP vuota con tubo viene inserita nella porta OUT.
   4. Usa il metodo push/pull per infondere lentamente il mezzo di perfusione nella porta di afflusso per riempire la conchiglia oculare posteriore mentre contemporaneamente estrai lentamente il mezzo di perfusione attraverso la siringa di deflusso per rimuovere eventuali bolle d'aria dalle linee. Interrompere l'infusione del fluido una volta che entrambi i tubi IN e OUT sono privi di bolle d'aria.
   5. Blocca i rubinetti in posizione off. Rimuovere la siringa da 30 ml dal gruppo filtro della porta IOP IN e riempirla con 30 ml di terreno. Quindi, sostituire la siringa con il gruppo filtro.
7. Configurazione camera ICP (superiore)
   1. Posiziona la camera/coperchio ICP (superiore) sul retro del segmento posteriore. Assicurarsi che il nervo ottico si trovi all'interno della camera superiore. Sigillare la camera superiore con quattro viti.
   2. Inserisci il tubo nelle porte IN e OUT della camera ICP (superiore). La siringa di afflusso ICP con tubo contenente fluido viene inserita nella porta IN e la siringa di uscita ICP vuota con tubo viene inserita nella porta OUT.
   3. Infondi delicatamente e lentamente il mezzo nella porta IN per riempire la camera ICP e rimuovere le bolle d'aria dalle linee usando il metodo push/pull. Interrompere l'infusione del fluido una volta che la camera ICP e i tubi IN e OUT sono privi di bolle d'aria.
   4. Blocca i rubinetti in posizione off. Rimuovere la siringa da 30 ml dal gruppo filtro ICP in port e riempirla con 30 ml di terreno. Quindi, sostituire la siringa con il gruppo filtro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack	Amazon	B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometro, nero, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Larghezza (confezione da 100)	Amazon	B000FMYRHK
30 mL Siringhe senza ago	Vitality Medical	302832
Rubinetto a 3 vie, 2 luer lock femmina, luer lock maschio girevole, tappo ventilato	QOSINA	2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & cacciavite Phillips di dimensioni appropriate	Brikksen Stainless Steel Fastners	PPMSSSCH4C.5
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE	Fisher Scientific	NC9085343
Betadine	Purdue	PUR1815001EACH
Corning 100 x 20mm trattato con coltura di tessuti piatti di cultura	Sigma-Aldrich	CLS430167-100EA
Corning L-glutammine Solution	Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Curity Garza Spugna, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS	Med Plus Medical Supply	COV-3033-CS
Pinza da medicazione Delicata curva (seghettata)	Katena	K5-4010
Dumont #5 - Fine Forceps	F.S.T.	11254-20
Eye Scissors Standard Curved	Katena	K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dish	Capitol Scientific	351058
Fisherbrand 4 oz. Contenitori per campioni	Fisher Scientific	16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-54
Buste per sterilizzazione a chiusura istantanea Fisherbrand	Fisher Scientific	01-812-55
Fisherbrand Buste per sterilizzazione a chiusura istantanea	Fisher Scientific	01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium	Fisher Scientific	SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution	Fisher Scientific	SV30010
Filtro idrofilo con ingresso Luer Lock femmina, uscita Luer Slip maschio, blu e trasparente	Qosina	28217
Trasduttori di pressione idrostatica, DELTRAN ® II, Catalogo # DPT-200 con una portata di 3CC/HR	AD instruments	DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box	Jenson Global	JG15-0.5HPX 15
Keyence B2‐X710 microscope	Keyence	B2-X710
LabChart 8	AD instruments	LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer	Leica	ST5020
Tappo Luer Lock Universale Non Ventilato, Bianco	QOSINA	65811
Octal Bridge Amp (Modello # FE228)	AD instruments	FE228
Pharmco Products ALCOOL ETILICO, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398
Soluzione tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Modello # PL3508)	AD instruments	PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant con DAPI	ThermoFisher	P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Adapter Straight, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male	McMAster-Carr	7880T113
Raccordo per tubo push-to-connect con filettatura universale per aria e acqua, adattatore, tubo da 1/8" OD x 1/8 tubo	McMAster-Carr	51235K101
Tubo flessibile Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 500 ft.	Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
Forbici chirurgiche - Sharp-Blunt	F.S.T.	14001-14
Pinze per tessuti delicate 1x2 denti curvi	Katena	K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS)	Centro di scienze della salute dell'Università del Texas del Nord	N/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometro, Nero, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna)	Marco Rubber & Plastics	B1000-030