Sviluppo di un modello di pressione translaminare utilizzando un sistema autonomo translaminare

Abstract

Fonte: Sharma, T. P., et al., Modello di sistema autonomo translaminare per la modulazione della pressione intraoculare e intracranica nei segmenti posteriori di donatori umani. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra la procedura di preparazione di un occhio umano per studiare gli effetti della pressione translaminare sulla segnalazione delle cellule gangliari retiniche simulando le pressioni intraoculari e intracraniche in un sistema translaminare autonomo.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Preparazione e sterilizzazione di attrezzature e forniture

1. Consulta la Tabella dei Materiali per un elenco completo delle forniture richieste, nonché i numeri di fornitore e catalogo.
2. Prima dell'uso, sterilizzare tutte le attrezzature e gli strumenti in autoclave o utilizzando fiale di ossido di etilene.

2. Preparazione del terreno

1. di perfusioneAggiungi l'1% di penicillina-streptomicina (10.000 U/mL di penicillina, 10.000 μg/mL di streptomicina in 0,85% di NaCl) e l'1% di L-glutammina (200 mM) a 1.000 mL di terreno di Eagle's modificato da Dulbecco (DMEM).
2. Sterilizza il mezzo di perfusione passando attraverso un filtro da 0,22 μm.

3. Impostazione

1. del sistema autonomo translaminare (TAS)Imposta le siringhe di afflusso (serbatoi di pressione intraoculare (IOP) e pressione intracranica (ICP)).
   1. Aggiungi 30 ml del mezzo di perfusione (sezione 2) a una siringa da 30 ml. Collegare un rubinetto a 3 vie alla siringa da 30 ml. Collegare un filtro idrofilo da 0,22 μm al rubinetto a 3 vie. Collegare un adattatore per tronchetto Luer da 15 G al filtro idrofilo da 0,22 μm.
   2. Rimuovi le bolle d'aria dalla configurazione della siringa. Collegare il tubo all'adattatore per tronchetto Luer da 15 G. Chiudere la porta laterale del rubinetto con un tappo di bloccaggio universale non ventilato. Ripetere per un totale di due configurazioni.
   3. Etichetta una siringa come pressione intracranica del canale 1 (CH1 ICP) e l'altra siringa come pressione intraoculare del canale 2 (CH2 IOP).
2. Imposta le siringhe di deflusso (serbatoi IOP e ICP).
   1. Attacca un rubinetto a 3 vie a una siringa da 30 ml. Collegare un adattatore per tronchetto Luer da 15 G al rubinetto a 3 vie. Collegare il tubo all'adattatore per tronchetto Luer da 15 G.
   2. Chiudi la porta laterale del rubinetto con un tappo di chiusura universale non ventilato. Ripetere per un totale di due configurazioni. Etichettare una siringa come CH1 ICP e l'altra siringa come CH2 IOP.

4. Preparazione dell'intero globo oculare umano

NOTA: Se vengono ricevuti occhi interi, segui la procedura seguente per separare il segmento anteriore dal segmento posteriore dell'occhio. Se gli occhi vengono ricevuti divisi in due, iniziare dal passaggio 4.4.

1. Metti un occhio intero nella soluzione di iodio povidone per 2 minuti.
2. Risciacqua l'occhio in una soluzione sterile tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere lo iodio povidone. Ripeti due volte.
3. Rimuovi gli annessi dall'intero globo oculare usando pinze e forbici. Dividere in due l'occhio all'equatore per separare i segmenti anteriore e posteriore dell'occhio.
4. Rimuovi la guaina del nervo ottico. Rimuovere l'umor vitreo dal segmento posteriore.
5. Taglia la sclera aggiuntiva dal segmento posteriore, se necessario, per garantire un buon adattamento sulla cupola rotonda della camera IOP (inferiore). Usando una pinza, assicurati che la retina sia distribuita uniformemente sulla parte posteriore del segmento.
6. IOP (inferiore) configurazione della camera
   1. Posiziona il segmento posteriore umano nella camera IOP (inferiore) del TAS sopra la cupola rotonda con il nervo ottico rivolto verso l'alto.
   2. Sigilla il segmento posteriore utilizzando l'O-ring in resina epossidica con quattro viti, garantendo una tenuta ermetica.
   3. Inserisci il tubo nelle porte IN e OUT della camera IOP (inferiore). La siringa di afflusso IOP con tubo contenente fluido viene inserita nella porta IN e la siringa di deflusso IOP vuota con tubo viene inserita nella porta OUT.
   4. Usa il metodo push/pull per infondere lentamente il mezzo di perfusione nella porta di afflusso per riempire la conchiglia oculare posteriore mentre contemporaneamente estrai lentamente il mezzo di perfusione attraverso la siringa di deflusso per rimuovere eventuali bolle d'aria dalle linee. Interrompere l'infusione del fluido una volta che entrambi i tubi IN e OUT sono privi di bolle d'aria.
   5. Blocca i rubinetti in posizione off. Rimuovere la siringa da 30 ml dal gruppo filtro della porta IOP IN e riempirla con 30 ml di terreno. Quindi, sostituire la siringa con il gruppo filtro.
7. Configurazione camera ICP (superiore)
   1. Posiziona la camera/coperchio ICP (superiore) sul retro del segmento posteriore. Assicurarsi che il nervo ottico si trovi all'interno della camera superiore. Sigillare la camera superiore con quattro viti.
   2. Inserisci il tubo nelle porte IN e OUT della camera ICP (superiore). La siringa di afflusso ICP con tubo contenente fluido viene inserita nella porta IN e la siringa di uscita ICP vuota con tubo viene inserita nella porta OUT.
   3. Infondi delicatamente e lentamente il mezzo nella porta IN per riempire la camera ICP e rimuovere le bolle d'aria dalle linee usando il metodo push/pull. Interrompere l'infusione del fluido una volta che la camera ICP e i tubi IN e OUT sono privi di bolle d'aria.
   4. Blocca i rubinetti in posizione off. Rimuovere la siringa da 30 ml dal gruppo filtro ICP in port e riempirla con 30 ml di terreno. Quindi, sostituire la siringa con il gruppo filtro.

Materials