Questo video mostra un test per studiare la capacità fagocitaria di cellule simili alla microglia utilizzando sinaptosomi marcati con coloranti fluorescenti sensibili al pH.
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Articolo metodologico
Saggio di fagocitosi su cellule vive di cellule simili alla microglia utilizzando sinaptosomi umani
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28 aprile 2025
In questo articolo
Abstract
Protocollo
Saggio di fagocitosi su cellule vive
- Plate 20-30 × 10 4 PMP in piastre da 96 pozzetti in 100 μL di terreno completo iMG e segui il processo di differenziazione per 10 giorni.
- Il giorno del test, prepara la soluzione di colorazione nucleare aggiungendo 1 goccia di un colorante nucleare per cellule vive in 2 mL di terreno basale iMG.
- Rimuovi 40 μL di terreno per pozzetto della piastra da 96 pozzetti e aggiungi 10 μL della soluzione di colorazione nucleare utilizzando una pipetta multicanale. Incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO2 per 2 ore.
- Scongela i sinaptosomi etichettati sul ghiaccio e sonica delicatamente usando un sonicatore ad acqua per 1 minuto. Trasferisci immediatamente i sinaptosomi sul ghiaccio. Diluire i sinaptosomi marcati in terreno completo iMG con un rapporto di 1 μL di sinaptosomi per 50 μL di terreno.
NOTA: La concentrazione di sinaptosoma dipende dal test e potrebbe richiedere un'ottimizzazione. Per mantenere una percentuale relativamente bassa (cioè 0,1% o meno) di DMSO nel terreno, si consiglia di non aggiungere più di 2 μL di sinaptosomi per pozzetto. - Come controllo negativo, pretrattare alcuni pozzetti con citocalasina D per inibire la polimerizzazione dell'actina e, quindi, la fagocitosi. Preparare una soluzione di citocalasi D 60 μM in terreno completo iMG. Aggiungere 10 μl di questa soluzione a ciascun pozzetto per una concentrazione finale di 10 μM e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 30 minuti.
- Rimuovi la piastra dall'incubatore e incuba a 10 °C per 10 min. Mantieni la piastra sul ghiaccio e aggiungi 50 μL di terreno contenente sinaptosomi.
- Centrifuga la lastra a 270 × g per 3 min a 10 °C e mantieni la lastra sul ghiaccio fino all'acquisizione dell'imaging.
- Acquisizione e analisi dell'imaging
- Inserisci la piastra in un lettore di imaging di cellule vive e seleziona i pozzetti da analizzare.
- Seleziona un obiettivo 20x.
- Regola la messa a fuoco, l'intensità del diodo a emissione di luce (LED), il tempo di integrazione e il guadagno dei canali del campo chiaro e del blu (4',6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI]). La fluorescenza dei sinaptosomi dovrebbe essere trascurabile al momento iniziale. Utilizzare il canale del campo chiaro come riferimento per mettere a fuoco il canale rosso (RFP). Il tempo di integrazione e il guadagno possono variare tra gli esperimenti; utilizzare queste impostazioni iniziali per il canale rosso: LED: 4, tempo di integrazione: 250 e guadagno: 5.
- Seleziona il numero di singole tessere da acquisire in un montaggio per pozzetto (ad esempio, acquisisci 16 tessere al centro del pozzo, visualizzando così circa il 5% dell'area totale del pozzo). Impostare la temperatura a 37 °C e l'intervallo di tempo desiderato per l'imaging.
NOTA: Le immagini sono state acquisite ogni 1 - 2 ore per un massimo di 16 ore in questo studio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali per colture cellulari | |||
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Tecnologia | 77004 | Riferito alla lamina 521 |
| Componenti del supporto di base iMG | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010< | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Concentrazione finale 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | Concentrazione finale 1x |
| Penicillina-Streptomicina (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Concentrazione finale 100 U/mL |
| Componenti di iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Concentrazione finale 55 μM |
| IL-34 | PeproTech o Biologend | 200-34 o 577904 | Concentrazione finale 100 ng/mL |
| iMG base media | < | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Concentrazione finale 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | Concentrazione finale 50 ng/mL |
| Saggio di fagocitosi coloranti | |||
| NucBlue Live Ready reagent< | R37605 | < | |
| ThermoFisher Scientific | P36600 | Riferito come colorante | |
| Altri reagenti per colture cellulari | |||
| Cytochalasin D | Sigma | Concentrazione finale 10 μM | |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuga | Eppendorf | Modello 5810R | |
| Cytation 5 lettore di imaging di cellule vive | Biotek | < | |
| Biotek | version 3.03 |
