Rilevamento del cotrasportatore neuronale potassio-cloruro 2 fosforilato tramite Western Blotting

Abstract

Fonte: Josiah, S. S., et al. Studio delle funzioni e delle attività del co-trasportatore K-Cl neuronale KCC2 mediante Western blotting. J. vis. exp. (2022).

Il video mostra i passaggi per rilevare e quantificare la proteina cotrasportatore 2 fosforilata del cloruro di potassio (KCC2) in un lisato cellulare. Questo processo prevede l'immunoprecipitazione per isolare la KCC2 fosforilata e la chemiluminescenza per quantificare la proteina isolata.

Protocollo

1. Coltura cellulare e trasfezione

1. Riscaldare tutti i reagenti nel bagno di perle (37 °C) prima della procedura di coltura cellulare. Preparare il terreno di coltura, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), integrato con il 10% di siero fetale bovino, l'1% ciascuno di 2 mM di L-glutammina, 100 volte l'aminoacido non essenziale, 100 mM di piruvato di sodio e 100 unità/ml di penicillina-streptomicina.
2. Scongelare 293 cellule di rene embrionale umano KCC2b di ratto trasfettate stabilmente (HEK293^rnKCC2b) completamente nel bagno di perle (37 °C). Trasferire le cellule dalla provetta crioviale in una provetta da centrifuga contenente 5 mL di terreno fresco. Centrifugare la cella a 1200 ×g per 3-5 minuti.
3. Utilizzare una pipetta aspiratore (fissata a una pompa a vuoto) per aspirare il surnatante e aggiungere 10 mL di terreno fresco per risospendere le cellule. Trasferire la sospensione cellulare in un piatto piatto da 10 cm.
4. Mettere la capsula nell'incubatrice e lasciarla crescere per 48 ore a 37 °С in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂. Monitorare il periodo di incubazione per garantire una crescita cellulare sana. Dividere ulteriormente le cellule quando hanno raggiunto oltre il 90% di confluenza dopo il periodo di incubazione.
5. Aspirare il vecchio terreno dalla capsula delle cellule e sciacquare delicatamente le cellule con 2 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS). Aggiungere 2 mL di tripsina e incubare per circa 1-2 minuti a temperatura ambiente.
6. Utilizzare 2 ml di terreno completo per lavare delicatamente le cellule tripsinizzate nel piatto. Aggiungere 9 ml di terreno fresco ai nuovi piatti e aggiungere 1 ml di soluzione dal vecchio piatto a ciascuno dei nuovi. Trasferire le piastre a celle divise nell'incubatore per 48 ore per raggiungere ≥ confluenza del 90%.
7. Trattare le cellule con dimetilsolfossido (DMSO) come controllo, 8 μM di staurosporina o 0,5 mM di N-etilmaleimmide (NEM) per 15 minuti prima di raccogliere le cellule nel tampone di lisi.

2. Preparazione dei lisati cellulari e caricamento dei campioni

1. Aspirare il terreno sulla piastra di coltura (dalle procedure di trasfezione). Posizionare la coltura cellulare sul ghiaccio e lavare le cellule con PBS ghiacciato.
2. Aspirare il PBS, quindi aggiungere 1,0 mL di tampone di lisi ghiacciato contenente 50 mM di tris-HCl (pH 7,5), 1 mM di glicole etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N',N'-tetraacetico (EGTA), 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 50 mM di fluoruro di sodio, 5 mM di pirofosfato di sodio, 10 mM di sodio-β-glicerofosfato, 1 mM di ortovanadato di sodio, 1% (p/v) Triton X-100, 0,27 M di saccarosio, 1 mM di benzamina, 0,1% (v/v) di 2-mercaptoetanolo e 2 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) nella capsula.
   NOTA: Il volume del tampone di lisi durante la raccolta delle cellule varia a seconda delle dimensioni della capsula, ad esempio, 1 mL di tampone di lisi è adatto per 1 x 10⁷ cellule/100 mm di piastra/150 cm² di fiaschetta, mentre 0,5 mL è adatto per 5 x 10⁶ cellule/60 mm di piatto/75 cm² di pallone.
3. Utilizzare un raschietto per celle di plastica fredda per raschiare le cellule dal fondo del piatto, quindi utilizzare delicatamente una pipetta per trasferire la sospensione cellulare in una provetta per microcentrifuga già sul ghiaccio. Agitare costantemente la provetta per 30 minuti a 4 °C.
4. Centrifugare i lisati cellulari in una centrifuga fredda (4 °C) a 16.000 x g per 20 minuti, rimuovere delicatamente la provetta dalla centrifuga e metterla sul ghiaccio. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco pre-raffreddato e scartare il pellet.
   NOTA: Potrebbe essere necessario variare la forza e il tempo di centrifugazione a seconda del tipo di cella. Tuttavia, le linee guida generali incoraggiano la centrifugazione a 16.000 x g per 20 minuti. Tuttavia, questo deve essere determinato per ogni esperimento. Ad esempio, le cellule delicate come i leucociti necessitano di una velocità di centrifugazione molto leggera.

3. Preparazione di immunoprecipitanti da lisati cellulari

1. Pipettare 300 μL di proteina-G-sefarosio in una provetta per microcentrifuga. Centrifugare la soluzione a 500 x g per 2 minuti e scartare il surnatante.
2. Aggiungere 500 μL di PBS e agitare bene la soluzione. Centrifugare la soluzione a 500 x g per 2 minuti e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio.
3. Mescolare 1 mg di anticorpi anti-KCC2 Thr906 e anti-KCC2 Thr1007 con 200 μL di perle di proteina G-sefarosio e portare il volume a 500 μL con PBS. Agitare su una piattaforma vibrante o una ruota rotante per 2 ore a 4 °C. Lavare 2 volte con PBS.
4. Effettuare la quantificazione delle proteine su tutti i lisati cellulari e aggiungere 1 mg di lisato cellulare alle perle lavate. Incubare delicatamente in un rotatore end-to-end per 2 ore a 4 °C. Centrifugare le perle e lavarle 3 volte con PBS contenente 150 mM di cloruro di sodio (NaCl).
5. Lavare gli immunoprecipitanti (sfere) 3 volte con 200 μL di PBS. Risospendere il pellet finale in 100 μl di tampone campione 1x dodecil solfato di litio (LDS).
6. Agitare le provette in un agitatore a rotore a temperatura ambiente per 5 minuti e incubarle in un blocco riscaldante a 75 °C per 10 minuti. Centrifugare il campione di carico a 11.000 x g per 2 minuti e utilizzare il surnatante per il caricamento del gel.

4. Esecuzione del western blot

1. Assemblare l'apparato di colata e versare il gel separatore all'8% appena preparato (vedere Tabella 1 per ricetta/preparazione) per colare il gel lasciando circa 2 cm di spazio dalla parte superiore del vetro colato. Aggiungere 200 μL di isopropanolo assoluto al setup e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 60 min.
   NOTA: La ricetta del gel di poliacrilammide per l'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) dipende dalle dimensioni della proteina di interesse (Tabella 2). Quindi, prendi nota della dimensione delle proteine prima di determinare la percentuale di gel desiderata.
2. Utilizzare una pipetta per rimuovere l'isopropanolo e sciacquare accuratamente il gel con circa 200 μL di acqua distillata. Aggiungere il gel di impilamento al 6% appena preparato (vedere Tabella 1 per ricetta/preparazione) per riempire lo spazio di circa 2 cm sul setup di fusione. Inserire delicatamente il pettine a fontana e lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.
3. Fissare il gel colato nel serbatoio dell'elettroforesi.
4. Sciogliere 30,3 g di Tris base, 144,1 g di glicina e 10 g di SDS in 1000 ml di acqua distillata per preparare 10 tamponi di trasferimento. Preparare 1 tampone di corsa aggiungendo 10 mL di SDS al 10% e 100 mL di tampone di trasferimento 10x a 890 mL di acqua distillata.
5. Versare 1 tampone in esecuzione nel serbatoio. Caricare 5 μL di marcatore di peso molecolare nel primo pozzetto e una quantità uguale di proteine in ciascun pozzetto del gel SDS-PAGE (tra 18-30 μL, a seconda delle dimensioni del pettine utilizzato). Riempire i pozzetti vuoti con 1x LDS e far scorrere il gel per circa 90-120 minuti a 120 V.
6. Sciogliere 58,2 g di base Tris e 29,3 g di glicina in 1000 mL di acqua distillata per preparare 10x tampone di trasferimento. Attivare la membrana in nitrocellulosa con 1x tampone di trasferimento contenente il 20% di metanolo. Sciacquare il gel e la membrana con il tampone di trasferimento e stenderli delicatamente sulla pila di preparazione.
   NOTA: Non c'è bisogno di regolare il pH dei tamponi di corsa e di trasferimento in quanto dovrebbero essere al pH ottimale richiesto. Inoltre, si consiglia di preparare questi tamponi e conservarli a temperatura ambiente prima dell'esperimento per risparmiare tempo.
7. Disporre il sandwich da trasferire in questo ordine: elettrodo negativo (cornice/estremità nera) - schiuma sandwich - carta da filtro - gel SDS-PAGE risciacquato - membrana nitrocellulosica risciacquata - carta da filtro - schiuma sandwich - elettrodo positivo (cornice rossa). Impilare il sandwich assemblato nel serbatoio di trasferimento e farlo funzionare a 90 V per 90 minuti o a 30 V per 360 minuti.

5. Colorazione degli anticorpi e sviluppo dell'immagine

1. Rimuovere la membrana e lasciarla asciugare. Bloccare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando un tampone bloccante a base di latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata con Tris contenente lo 0,1% di 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. Incubare le membrane con appropriate diluizioni dell'anticorpo primario^8,15,19 e della beta-actina (controllo del carico) in tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C. Lavare la membrana in tre lavaggi di 1x TBS-T per 5 minuti ciascuno.
   NOTA: L'incubazione della membrana separata con controlli di carico come gli anticorpi beta-actina, alfa-tubulina o gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi serve a normalizzare gli altri risultati del western blotting durante la successiva quantificazione. La diluizione raccomandata per ciascun anticorpo primario è disponibile nel manuale del produttore.
3. Incubare la membrana lavata con l'anticorpo secondario diluito 5000 volte in tampone bloccante per 60 minuti a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare la membrana 3 volte in 1 TBS-T per 5 minuti ciascuna.
   NOTA: È altamente raccomandato che l'anticorpo secondario debba essere sollevato contro la specie in cui viene allevato l'anticorpo primario. Ad esempio, se l'anticorpo primario del KCC2 totale è un anti-KCC2 di topo, deve essere utilizzato l'anticorpo secondario per l'anti-topo.
4. Posizionare la membrana lavata sulla scheda di imaging. Mescolare volumi uguali di ciascun reagente a chemiluminescenza potenziata (ECL) e distribuire delicatamente la soluzione miscelata sulla membrana per sviluppare i segnali.

6. Acquisizione di immagini utilizzando un sistema di imaging e quantificazione dei dati

1. Trasferire la scheda di imaging nel compartimento appropriato del sistema di imaging per l'imaging. Aprire il software di imaging sul computer per l'elaborazione delle immagini.
2. Sulla barra degli strumenti, fai clic su Nuovo protocollo e scegli Canale singolo. Fare clic su Selezionare nella finestra di dialogo per l'imaging/applicazione del gel, scorrere fino a Blot e selezionare Chemi Hi Sensitivity o Chemi Hi Resolution. Quindi fare clic su Signal Accumulation Setup per impostare la durata e il numero di immagini da acquisire.
3. Fare clic su Posiziona gel in configurazione protocollo e regolare il gel nel sistema di imaging, se necessario. Fare clic su Esegui protocollo per acquisire le immagini.
4. Fare clic con il pulsante destro del mouse su una delle immagini acquisite nella casella del catalogo immagini per salvare le immagini sul computer. Passare all'immagine desiderata e fare clic su Seleziona immagine e continua nella finestra di dialogo Esegui.
5. Fare clic sull'icona Image Transform per regolare il contrasto e la saturazione dei pixel dell'immagine. Fare clic sull'icona Screenshot sulla barra degli strumenti generale per salvare l'immagine sul computer a seconda del formato immagine desiderato.
6. Misura le densità di banda utilizzando il software ImageJ e analizzale utilizzando strumenti statistici appropriati.

Risultati

Tabella 1: Ricetta per fare la miscela di gel di poliacrilammide (separare e impilare le soluzioni di gel).

8 mL di gel separatore a...

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