Induzione di un'elevata pressione intraoculare in un modello di ratto

Abstract

Fonte: Lani-Louzada, R., et al., Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video dimostra l'induzione e il monitoraggio di un'elevata pressione intraoculare (IOP) in un modello di ratto. Il processo prevede la cauterizzazione dei vasi sanguigni limbari, con conseguente occlusione dei vasi e IOP elevata. Il ratto viene quindi lasciato riprendersi e la IOP viene regolarmente monitorata sia nell'occhio sperimentale che in quello di controllo per il confronto.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

Nel presente lavoro sono stati utilizzati ratti incappucciati Lister di entrambi i sessi, di età compresa tra 2 e 3 mesi e del peso di 180-320 g. Tuttavia, la procedura può essere adattata a diversi ceppi di ratti di varie fasce d'età.

Chirurgia dell'ipertensione oculare e follow-up clinico

1. Animali da interno in un ambiente a temperatura controllata e ciclo luce/buio di 12 ore (6 am: luce accesa/ 6 pm: luce spenta) con cibo standard pellettizzato irradiato con raggi gamma (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brasile) e acqua (triplo filtro, con carbone attivo non tossico) disponibile ad libitum.
2. Prepara una miscela di cocktail anestetico composta da tre parti di ketamina cloridrato al 10% e una parte di xilazina cloridrato al 2% (diluente: acqua sterile).
3. Trattieni delicatamente l'animale tenendo la pelle dorsale e induci l'anestesia mediante somministrazione intraperitoneale di 1 μL/g di peso corporeo della miscela (ketamina: 75 mg/kg; xilazina: 5 mg/kg). Verificare la corretta anestesia dopo circa 5 minuti eseguendo una risposta di pizzicamento delle dita.
4. Anestetizzare topicamente entrambe le superfici oculari instillando proxymetacaina cloridrato 0,5% collirio. Attendere 30-60 s e rimuovere la soluzione rimanente dalla faccia anteriore del globo, toccando delicatamente la congiuntiva bulbare nasale o laterale con un piccolo batuffolo di cotone sterile.
5. Misura la IOP di base degli occhi di controllo sia sperimentali che controlaterali posizionando l'animale in una posizione di decubito ventrale sul banco di lavoro in modo che la superficie corneale sia facilmente accessibile alla punta del tonometro.
6. Usa il tonometro portatile ad applanazione o a rimbalzo (Figura 1A). Posizionare la punta del tonometro in modo che tocchi leggermente la zona corneale centrale perpendicolarmente. Acquisisci e calcola la media di 3-5 medie affidabili generate dalla macchina. Ogni media viene calcolata automaticamente dal dispositivo dopo sei misurazioni individuali riuscite.
   1. Carica il tonometro di rimbalzo con una sonda e premi una volta il pulsante di misurazione per accenderlo, posizionando la punta del dispositivo verso l'alto per evitare che la sonda cada. Dopo averlo acceso, il display visualizzerà 00 indicando che l'apparecchiatura è pronta per la misurazione.
   2. Posiziona il dispositivo con la punta della sonda a 1-4 mm dalla cornea e acquisisci le misurazioni premendo rapidamente e con attenzione il pulsante di misurazione, senza spostare l'apparecchiatura. Ogni misurazione riuscita viene identificata da un breve segnale acustico e dopo sei volte, la media viene visualizzata sullo schermo del dispositivo.
      NOTA: Nonostante una lunga esperienza con il tonometro ad applanazione, per ottimizzare l'intera procedura gli autori raccomandano l'uso di un tonometro a rimbalzo, che fornisce un'acquisizione più facile di una misurazione affidabile della IOP.
7. Posiziona l'animale in una leggera posizione di decubito laterale sotto uno stereomicroscopio e pianifica attentamente l'intervento chirurgico ispezionando l'occhio sperimentale con un ingrandimento di 40x. Non dimenticare di mantenere lubrificato l'occhio di controllo controlaterale durante la procedura instillando una goccia di carmellosa sodica o ialuronato di sodio.
8. Con l'aiuto di una pinza curva, spingi delicatamente in avanti il bulbo oculare sperimentale in modo da esporre la vascolarizzazione che circonda a 360° il limbus. Con l'altra mano, cauterizzare delicatamente i vasi intorno alla cornea con un cauterizzato oftalmico a bassa temperatura (1.300 °F; Bovie Medical, USA) (Figura 1B-E).
   NOTA: Il cauterio menzionato ha una punta rotonda che dovrebbe toccare longitudinalmente la vascolarizzazione limbare.
9. Fai attenzione a non cauterizzare la periferia corneale, poiché ciò potrebbe provocare un'opacizzazione corneale post-operatoria, che preclude la valutazione in vivo della funzione retinica.
10. Osserva l'emergere di piccoli segni circolari di cauterizzazione sul limbus sclerale, l'obliterazione della vascolarizzazione limbare e la dilatazione della pupilla nell'occhio operato, che sono segni di una procedura chirurgica riuscita.
    NOTA: Poiché la vascolarizzazione limbare di ratti e topi è anatomicamente simile e il cauterio utilizzato ha una piccola punta delicata, questo protocollo può funzionare anche per l'occhio del topo senza alcun adattamento.
11. Dopo l'intervento, controlla la IOP post-operatoria immediata in entrambi gli occhi come descritto nel passaggio 1.5.
12. Applicare una goccia di acetato di prednisolone oftalmico (1,2 mg/mL) e mantenerla a contatto con la superficie anteriore dell'occhio sperimentale per circa 40 s, quindi sostituirla con un unguento oftalmico di antibiotici (ossitetraciclina cloridrato 30 mg/g più polimixina B 10.000 U/g; o ciprofloxacina 3,5 mg/g). Eseguire l'iniezione intramuscolare di tramadolo cloridrato (dose singola; 2 mg/kg) per prevenire il dolore dopo la procedura.

Risultati

Figura 1: Cauterizzazione termica del plesso vascolare limbare e conseguenze sulla funzione retinica in vivo. (A) Metodi alternativi per misurare la IOP nei ratti: tonometria a rimbalzo (superiore) e tonometria ad applanazione (inferiore). (B-E) Procedura chirurgica; Punta di freccia: plesso vascolare limbare; freccia: pinza cur...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx	Bovie Medical Corporation	AA00	Cautery Bassa temperatura oculistica cauteristica
Cetamin	Syntec do Brasil Ltda	000200-3-000003	Ketamina cloridrato 10%
Ecofilm	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0487	Carmellose sodico 0.5%
Hyabak	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-8042140002	Sodio ialuronato 0.15%
Icare Tonolab	Icare Finland Oy	TV02 (numero di modello)	Rebound handheld tonometer
Maxiflox	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0489	Ciprofloxacin 3.5 mg/g
Ster MD	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-1.0497.1287	Prednisolone acetato 0.12%
Terolac	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0497.1286	Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina	Laboratórios Pfizer Ltda	MS-1.0216.0024	Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/ g + polimixina B 10,000 U/g
To 230635 nometro			portatile Tonometro
	Carl Zeiss-Stereomicroscopio		per chirurgia e dissezione retinica

portatile per applanazione digitale