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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Quantificazione dei somi delle cellule gangliari retiniche
NOTA: La seguente procedura è per la quantificazione dei soma RGC, basata sulla colorazione immunoistochimica di montature piatte retiniche con un anticorpo contro la proteina 3A del dominio omaobox/POU specifica per il cervello (Brn3a).
- Trasferire le retine isolate in una piastra di coltura a 24 pozzetti (una retina per pozzetto) contenente 1 mL di 1x PBS e mantenere la retina interna rivolta verso l'alto.
- Permeabilizzare i tessuti lavando 3 volte per 10 minuti con un tensioattivo non ionico allo 0,5% diluito in 1 PBS (0,3 mL). Quindi mantenere il tessuto agitando delicatamente in albumina sierica bovina al 5% (BSA) in tensioattivo non ionico al 2% e 1x PBS (soluzione bloccante; 0,25 mL) per 60 minuti a temperatura ambiente.
- Durante la fase 1.2, preparare la soluzione di anticorpi primari Brn3a diluendo 1:200 in tensioattivo non ionico 0,5% e 1x PBS più 5% BSA, e conservarla a 4 °C.
- Dopo 60 minuti di blocco tissutale, incubare le retine in 0,2 mL di soluzione di anticorpi primari a 4 °C per 72 ore agitando delicatamente.
- Lavare il tessuto 3 volte per 10 minuti con 1 PBS, quindi incubare il tessuto per 2 ore a temperatura ambiente in 0,2 ml di soluzione di anticorpi secondari diluita 1:750 in 1 PBS più il 5% di BSA.
- Inoltre, incubare il tessuto per 10 minuti in una soluzione di controcolorazione nucleare per la colorazione dei nuclei fluorescenti. Concludere l'immunoistochimica con una fase finale di lavaggio con 1x PBS (0,3 mL) ripetuto 3x.
- Trasferire le retine con l'aiuto di due piccoli pennelli su vetrini da microscopio, mantenendo il lato vitreo rivolto verso l'alto. Posizionare il quadrante dorsale retinico verso l'alto sui vetrini del microscopio. Eseguire altri due tagli radiali verso la testa del nervo ottico per delimitare gli altri 3 quadranti (nasale, ventrale e temporale).
NOTA: Le dimensioni di taglio non sono fisse. Non devono essere troppo corti da compromettere un efficiente appiattimento della retina sul vetrino e non devono essere troppo lunghi in modo da raggiungere il forame del nervo ottico e separare completamente il quadrante retinico delimitato dal resto del tessuto. - Infine, applicare 0,2 mL di terreno di montaggio anti-dissolvenza su un vetrino coprioggetti di vetro e posizionarlo sulla retina montata in piano per l'analisi microscopica dei tessuti. Per stimare la densità delle RGC, esaminare le montature piatte con un microscopio a epifluorescenza confocale utilizzando un obiettivo 40x/1,3.
- Per ogni quadrante della retina, scatta otto foto: due dalla retina centrale (~0,9 mm dal disco ottico), tre dalla retina media (~2,0 mm dal disco ottico) e tre dalla retina periferica (~3,7 mm dal disco ottico), per un totale di 32 foto per retina. Utilizzare il software FIJI per contare le celle Brn3a-positive e stimare la densità cellulare media.