Il video mostra una tecnica ex vivo per stimolare il sistema nervoso intracardiaco a valutare la suscettibilità del cuore all'aritmia. Utilizzando un apparato di perfusione, un cuore di topo isolato viene perfuso con un tampone ossigenato. Il sistema nervoso intracardiaco viene quindi stimolato ad alta frequenza per indurre aritmie.
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Articolo metodologico
Stimolazione del sistema nervoso intracardiaco per valutare la suscettibilità all'aritmia
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28 aprile 2025
In questo articolo
Abstract
Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione dell'apparato di Langendorff
NOTA: Viene utilizzato un sistema di perfusione di Langendorff disponibile in commercio.
- Preparare una soluzione modificata di Krebs-Henseleit (119 mM di cloruro di sodio, 25 mM di bicarbonato di sodio, 4,6 mM di cloruro di potassio, 1,2 mM di fosfato di potassio monobasico, 1,1 mM di solfato di magnesio, 2,5 mM di cloruro di calcio, 8,3 mM di glucosio e 2 mM di piruvato di sodio). Per prevenire la precipitazione del calcio, aggiungere alla soluzione di perfusione una miscela di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5%. Filtrare il tampone con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
- Aggiungere un agente farmacologico al tampone per studiare il suo effetto sull'elettrofisiologia cardiaca e sull'aritmogenesi, se necessario.
- Avviare il bagnomaria e posizionare la soluzione di perfusione contenente una miscela di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5%. Regolare la temperatura del bagnomaria, in modo che la temperatura della soluzione di perfusione direttamente prima della cannula sia di ~37 °C.
- Non appena viene raggiunta la temperatura corretta, avviare la pompa a rulli e riempire l'apparecchio con la soluzione di perfusione.
- Regolare la velocità della pompa prima di collegare il cuore, in modo che non rimangano bolle d'aria nella cannula durante il montaggio sull'apparecchio.
2. Preparazione hardware e software
- Collegare un sistema di acquisizione dati digitale e il relativo software all'apparato di Langendorff per una registrazione continua della pressione di perfusione, della portata e della frequenza cardiaca.
- Impostare la pressione di perfusione desiderata nelle impostazioni generali su 80 mmHg.
- Avvia la registrazione.
- Per la registrazione dei dati e la stimolazione con un generatore di stimoli digitale designato, utilizzare un catetere elettrofisiologico con elettrodi di platino, una superficie dell'elettrodo di 0,5 x 0,5 mm e una distanza tra gli elettrodi di 0,5 mm.
- Posizionare il catetere vicino all'area in cui verrà posizionato il cuore dopo il collegamento all'apparato.
- Preparare la stimolazione selezionando 2 elettrodi dal catetere e utilizzare una lunghezza del ciclo di 100 ms.
3. Preparazione del Cuore
- Aggiungere il tampone di perfusione freddo (~2 - 4 °C) (10 - 20 mL e 40 - 50 mL, in modo che l'intero piatto sia coperto) alle 2 piastre di Petri (diametri di 6 cm e 10 cm) e al piatto con la cannula, e posizionarli sul ghiaccio direttamente accanto e sotto il microscopio. Preparare un doppio nodo attorno alla cannula.
- Asportare rapidamente il cuore dopo la lussazione cervicale aprendo il torace usando le forbici Mayo e le pinze strette. Quindi afferrare l'aorta e la vena cava sopra il diaframma usando la pinza di Londra e asportare il blocco cuore-polmone tagliando tutti i vasi e il tessuto connettivo vicino alla colonna vertebrale con le forbici per lo strabismo.
- Trasferire il blocco cuore-polmone nel primo piatto (6 cm di diametro) riempito con il tampone ghiacciato e rimuovere con cura i polmoni senza danneggiare il cuore utilizzando le forbici per lo strabismo e il forcipe London. Quindi, posiziona il cuore al microscopio e rimuovi con cura il timo, l'esofago e la trachea usando le forbici a molla e le pinze Dumont SS.
- Utilizzare le forbici a molla per praticare un foro di 1,5 - 2 mm nella parte superiore dell'atrio destro per l'inserimento del catetere. Praticare un foro nell'arteria polmonare. Quindi tagliare l'aorta direttamente sotto i rami sopra-aortici e rimuovere il tessuto in modo che il nodo possa essere attaccato facilmente.
- Mantenere intatti i cuscinetti adiposi atriali, compreso il plesso ganglionato principale situato atrialmente, intorno all'atrio sinistro o rimuoverli completamente mediante un'attenta dissezione.
- Trasferire il cuore nel piatto con la cannula e metterlo sotto il microscopio. Tirare l'aorta sopra la cannula con la pinza Dumont SS e legare saldamente il nodo preparato attorno all'aorta. Assicurarsi che la cannula non sia posizionata troppo in profondità nell'aorta in modo che la valvola aortica e i vasi coronarici siano lasciati liberi.
- Collegare rapidamente la cannula all'apparecchio di Langendorff. Assicurati che non rimangano bolle nella cannula.
- Portare la pressione di perfusione a 80 mmHg, consentendo una perfusione a pressione costante.
- Inserire con cautela il catetere nell'atrio destro e nel ventricolo destro senza toccare o danneggiare il cuore e fissarlo alla cannula con del nastro adesivo.
- Iniziare la stimolazione con la durata del ciclo preparata di 100 ms per un periodo iniziale di equilibrio di 20 minuti.
- Chiudere la camera per consentire una temperatura stabile.
4. Parametri elettrofisiologici e aritmogenesi
- Applicare la stimolazione programmata tramite gli elettrodi distali o prossimali del catetere al doppio della soglia di stimolazione atriale o ventricolare per valutare i parametri elettrofisiologici, come descritto nei passaggi seguenti.
- Determinare il tempo di recupero del nodo del seno come la lunghezza massima del ciclo di ritorno dopo 10 s di stimolazione a velocità fissa a una lunghezza del ciclo S1S1 di 120 ms, 100 ms e 80 ms.
- Determinare il punto di Wenckebach come la lunghezza del ciclo S1S1 più lunga (8 stimoli; S1S1: 100 ms; riduzione graduale di 2 ms) con una perdita di conduzione linfonodale AV di 11. Determinare i periodi refrattari linfonodali atrioventricolari come i più lunghi S1S2 (12 stimoli; S1S1: 120 ms, 110 ms e 100 ms; un extrastimolo accoppiato in corto circuito con una riduzione graduale di S1S2 di 2 ms) con una perdita di conduzione nodale AV.
- Determinare i periodi refrattari atriali e ventricolari come i più lunghi S1S2 (12 stimoli; S1S1: 120 ms, 110 ms e 100 ms; un extrastimolo accoppiato corto con una riduzione graduale di S1S2 di 2 ms) con una risposta atriale o ventricolare assente.
- Eseguire un'extrastimolazione programmata (S1S1: 120 ms, 100 ms e 80 ms, seguita da un massimo di 3 battiti extra; 60 - 20 ms con una riduzione graduale di 2 ms) o protocolli di burst pacing (5 s a S1S1: 50 - 10 ms con una riduzione graduale di 10 ms) in linea con le Convenzioni di Lambeth per valutare l'aritmogenesi ventricolare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S3014 | Soluzione Krebs-Henleit modificata |
| Idrogenocarbonato di sodio< | Soluzione Krebs-Henleit modificata | ||
| Cloruro di potassio | Soluzione di Krebs-Henleit modificata | ||
| Potassio fosfato monobasico< | Soluzione Krebs-Henleit modificata | ||
| Solfato di magnesio eptaidrato< | Soluzione Krebs-Henleit modificata | ||
| Cloruro di calcio dihydrate< | Soluzione Krebs-Henleit modificata | ||
| Glucosio | Soluzione Krebs-Henleit modificata | ||
| Sodium pyruvate bioXtra< | Soluzione Krebs-Henleit modificata | ||
| Carbogen (95% ossigeno / 5% anidride carbonica) | |||
| Filtro sterile steritop-GP 0.22 | EMD Millipore< | ||
| Sistema di perfusione | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germania | 73-4343 | |
| Sistema di acquisizione dati e software corrispondente per catetere e parametri fisiologici | configurazione Langendorff | ||
| Catetere ottapolare | configurazione Langendorff | ||
| Generatore di stimoli< | Impostazione della stimolazione | ||
| Software di stimolazione | Impostazione della stimolazione | ||
| Plastic Wrap< | Materiali di consumo | ||
| Spring scissors< | Preparazione del cuore | ||
| Forbici per lo strabismo< | Preparazione del cuore | ||
| Mayo Scissors< | Preparazione del cuore | ||
| Dumont SS Forceps | Preparazione del cuore | ||
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 11080-02 | Preparazione del cuore |
| Narrow Pattern Forceps | Preparazione del cuore |
