Induzione di una lieve lesione cerebrale traumatica in un modello murino

Abstract

Fonte: Macheda, T., et. al. Modello a testa chiusa controllato elettromagneticamente di lieve lesione cerebrale traumatica nei topi. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra la procedura per indurre una lesione alla testa chiusa in un modello murino utilizzando un frame stereotassico. L'impatto controllato replica la lesione cerebrale traumatica lieve, consentendo ai ricercatori di studiare gli effetti neurologici e il recupero misurando i riflessi e il comportamento post-infortunio.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Procedura chirurgica

1. Fissare il mouse nel telaio stereotassico utilizzando barre auricolari a punta affusolata in resina acetalica leggera, una barra per morso e una maschera per anestesia per topo (vedi Figura 1G, H). Il gas isoflurano viene erogato al 2%-3% nell'aria ambiente a 100-200 mL/min. Monitorare attentamente la respirazione del topo per garantire la profondità dell'anestesia e regolare il livello di gas secondo necessità.
2. Applicare un lubrificante sterile per gli occhi sugli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea.
3. Sterilizzare il cuoio capelluto con tamponi di iodio povidone e tamponi imbevuti di alcol sterili tre volte.
4. Assicurati che il mouse sia profondamente anestetizzato verificando la mancanza di una risposta di pizzicamento delle dita.
5. Praticare un'incisione del cuoio capelluto di circa 1 cm sulla linea mediana tra gli occhi e il collo utilizzando un bisturi, esponendo il cranio (vedi Figura 1I).
6. Lasciare asciugare il cranio per 1-2 minuti.
7. Identificare il bregma (il punto di intersezione delle suture coronale e sagittale) e lambda (l'intersezione delle suture sagittale e lambdoide) (vedi Figura 1J).
   NOTA: Un atlante del cervello di topo potrebbe essere utilizzato come riferimento.
8. Posizionare l'apparecchio di supporto per la testa sotto la testa e gonfiare il bulbo con acqua fino a quando non preme contro la parte inferiore della testa del topo, ma senza sollevare la testa dalla barra del morso.
   NOTA: Questo passaggio è essenziale per ridurre i possibili problemi all'orecchio dovuti alla lesione alla testa chiusa (CHI). Qualsiasi animale con danni all'orecchio causati dalle barre auricolari, con conseguente rotolamento o sanguinamento, deve essere eliminato dallo studio e soppresso.
9. Spostare l'impattatore in posizione sopra la testa dell'animale.
10. Estendi l'impattatore posizionando l'interruttore a levetta Extend/Retract (sulla casella di controllo dell'impattatore) su Extend.
    NOTA: Assicurati di controllare che la punta sia completamente estesa tirando verso il basso la punta.
11. Allineare l'impattatore fino a quando non è centrato sulla bregma (vedi Figura 1K).
12. Reimpostare le coordinate stereotassiche digitali x e y nel lettore stereotassico a 0 (sul controllo del touch screen)
13. Allineare la sonda sulla posizione dell'impatto spostando la sonda dal bregma alle coordinate target: mediale-laterale = 0,0 mm, antero-posteriore = −1,6 mm.
14. Agganciare il sensore di contatto all'orecchio dell'animale.
    1. Abbassare lentamente la punta della sonda con la sonda estesa fino al primo contatto con la superficie. Fermarsi al segnale acustico.
    2. Reimpostare le coordinate z stereotassiche digitali nel lettore stereotassico su 0.
15. Ispezionare attentamente se la punta è a filo con il cranio (piani mediale-laterale e anteriore-posteriore).
    NOTA: Il posizionamento della punta della sonda è il passaggio più cruciale di questo processo per prevenire fratture del cranio e danni all'orecchio.
16. Ritrarre l'impattatore posizionando l'interruttore a levetta sulla scatola di controllo in posizione di ritrazione. La punta si ritira e non ha più contatto con la testa dell'animale fino al momento dell'impatto.
17. Impostare la profondità dell'impatto regolando la profondità dorso-ventrale a -1,2 mm.
    NOTA: La profondità dell'impatto influisce sulla gravità della lesione. La profondità dovrebbe essere titolata per diverse età, pesi e ceppi di topi fino alla gravità della lesione desiderata. Potrebbe essere necessario regolare/rititolare la profondità nel tempo per mantenere una gravità costante della lesione. La gravità può essere valutata dal punto di vista neuropatologico: microglia e astrociti (Immunoistochimica (IHC)) e dal punto di vista comportamentale: il labirinto d'acqua a braccio radiale e il test di evitamento attivo.
18. Monitorare attentamente la respirazione del topo per garantire la profondità dell'anestesia e regolare il livello del gas secondo necessità.
    NOTA: Spesso, la percentuale di gas isoflurano dovrebbe essere abbassata o spenta per 10-20 secondi prima dell'impatto. Osserva attentamente che la respirazione acceleri leggermente. Se la respirazione è troppo lenta al momento dell'impatto, l'animale può morire entro i primi 60 s dopo l'impatto per apnea. Questo può essere evitato regolando la profondità dell'anestesia nei secondi prima dell'impatto.
19. Induci l'impatto premendo l'interruttore a levetta destra su impact. La punta della sonda scende alla velocità visualizzata, quindi rimane abbassata per il tempo di permanenza impostato e si ritrae.
    NOTA: I topi fittizi ricevono una gestione identica a quella dei topi CHI, ma l'impatto non viene erogato.
20. Avvia il timer immediatamente dopo che l'impatto CHI è stato erogato per registrare i tempi di raddrizzamento (tempo per tornare dalla posizione laterale alla posizione prona) o avvia il timer quando il mouse viene rimosso dal telaio stereotassico per i topi finti. Il tempo medio del riflesso raddrizzante è di 5-15 minuti.
    NOTA: I tempi del riflesso raddrizzante possono variare in base alla tensione e all'età del topo.
21. Valutare i topi per fratture visibili del cranio, emorragie e apnea. Escludere dallo studio i topi con una frattura cranica depressa o un'emorragia visibile.
    NOTA: Ci sono livelli graduati di fratture del cranio. Gli animali con fratture craniche decompresse, in cui l'osso preme in modo osservabile nel tessuto cerebrale, vengono soppressi (CO₂ prima, e la decapitazione viene utilizzata come metodo secondario). Se la punta dell'impattatore è impostata correttamente, questi tipi di fratture del cranio sono estremamente rari. Se si verifica una frattura del cranio, la presentazione più comune è una piccola goccia di sangue sul cranio e una leggera ruvidità tattile del cranio, spesso lungo la sutura che collega la punta posteriore dell'osso nasale. Questi topi sono annotati come possibili fratture del cranio nei registri, ma normalmente non sono esclusi dallo studio.
22. Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico.
23. Chiudere il cuoio capelluto pinzando insieme la pelle.
    NOTA: Suture assorbibili o non assorbibili potrebbero essere utilizzate per chiudere il cuoio capelluto in alternativa alle graffette.
24. Applicare un unguento antibiotico triplo con un applicatore sterile con punta di cotone sull'incisione chiusa.
25. Rimetti il mouse in una gabbia di tenuta pulita per il recupero. Metà della gabbia di recupero si trova su un termoforo (impostazione bassa), che offre la possibilità di allontanarsi dal calore quando è sveglio e di mantenere la temperatura dell'animale mentre è incosciente (vedi Figura 1L).
    NOTA: Il mouse viene posizionato su un fianco nella gabbia di recupero. Per evitare il soffocamento, posizionare l'animale in una gabbia di recupero senza lettiera o su un fazzoletto se la lettiera è nella gabbia.
26. Riporta l'interruttore Estendi/Ritrai alla posizione Center/Off .
    NOTA: La corrente continuerà a funzionare se l'interruttore viene lasciato in posizione di estensione o di ritrazione, causando il rigonfiamento del pistone. Il dispositivo di simulazione non sarà quindi funzionante fino a quando il pistone non si sarà raffreddato.
27. Rimuovere l'impattatore dal suo supporto e posizionarlo delicatamente sull'impacco di ghiaccio.
    NOTA: Mantenere l'impattatore su un impacco di ghiaccio aiuta a ridurre il potenziale gonfiore dell'impattatore.
28. Monitorare l'animale fino a quando non si verifica il riflesso raddrizzante e documentare il tempo fino al raddrizzamento (vedi Figura 1M).
    NOTA: Il riflesso raddrizzante è definito come il momento in cui il mouse ritorna in posizione prona. La gabbia deve essere lasciata indisturbata; Il mouse potrebbe destra se la gabbia viene toccata, spostata o esposta a dei rumori.
29. Rimetti i topi nella loro gabbia di casa quando sono svegli e vigili. Di solito, entro 1 ora dall'infortunio, gli animali sono completamente coscienti e deambulano. Inoltre, aggiungi del cibo umido sul fondo della gabbia.

Risultati

Figura 1: Passaggio 1: Impostazione dell'area chirurgica. (A) Viene mostrato un esempio dell'area chirurgica e degli strumenti necessari per eseguire la chirurgia CHI (impacco di ghiaccio per l'impattatore, telaio stereotassico dotato di impattatore, scatola di controllo dell'impattatore e strumenti chirurgici). (B) Una vista ravvicinata d...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
9 mm Autoclip Applier	Braintree scientific	ACS- APL	Surgery
9 mm Autoclip Remover	Braintree scientific	ACS- RMV	Surgery
9 mm Autoclip, Cassa di 1.000 clip	Braintree scientific	ACS- CS	Surgery (Staples)
Software Aperio ImageScope	Leica BioSystems	NA	IHC
BladeFLASK Blade Remover	Fisher Scientific	22-444-275	Surgery
Applicatore con punta in cotone	VWR	89031-270	Surgery
Digitial mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730D	Surgery
Dumont #7 Forceps	Roboz	RS-5047	Surgery
Barre auricolari	Stoelting	51649	Surgery
EthoVision XT 11.0	Noldus Information Technology	NA	RAWM
Fiber-Lite	Dolan-Jeffer Industries	UN16103-DG	Surgery
Fisherbrand Bulb for Small Pipets	Fisher Scientific	03-448-21	Apparato
Gemini Avoidance System	Strumenti di San Diego	NA	Prevenzione
Pad riscaldante	Sunbeam	732500000U	Surgery prep
HRP coniugato capra anti-coniglio IgG	Jackson Immuno Research laboratories	111-065-144	IHC
Camera di induzione	Kent Scientific	VetFlo-0530XS	Surgery prep
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC: 11695-6777-2	Surgery
Testa per anestesia gassosa del topo holder	Stoelting	51609M	Surgery
Neuropactor Stereotaxic Impactor	Strumenti di neuroscienze	n/a	Surgery: Formalmente distribuito da Lecia come impact one
NexGen Mouse 500	Allentown	n/a	Post-operatorio, gabbia
Parafilm	Bemis	PM992	Apparato
Peanut - Tagliacapelli professionale	Whal	8655-200	Surgery prep
Soluzione di iodio povidone USP, 10% (p/v), 1% (p/v) disponibile Iodio, per laboratorio	Ricca	3955-16	Surgery
Puralube Vet Unguento, unguento oftalmico di petrolatino, Lubrificante oculare sterile	Dechra	17033-211-38	Surgery
Rabbit anti-GFAP style='width:149pt;'>Dako	Z0334	IHC
Rabbit anti-IBA1	Wako	019-19741	IHC
Labirinto d'acqua a braccio radiale a 8 bracci	MazeEngineers	n/a	RAWM
Scale	OHAUS CS series	BAL-101	Surgery prep
Manico per bisturi #7 solido 6.25"	Roboz	RS-9847	Surgery
Tamponi sterili per la preparazione dell'alcol (alcol isopropilico 70% v/v)	Fisher Brand	22-363-750	Surgery prep
Sistema di anestesia a basso flusso SumnoSuite	Kent Scientific	SS-01	Surgery
10 mL siringa Luer-Lok Tip	BD Bard-Parker	302995	Apparato
Timers	Fisher Scientific	6KED8	Chirurgia
Crema anestetica topica	L.M.X 4	NDC 0496-0882-15	Preparation Surgery
Unguento antibiotico triplo	Major	NDC 0904-0734-31	Post-chirurgia
Tubing	MasterFlex	96410-16	Apparecchio
Vaporizzatore Sistema di anestesia a canale singolo	Kent Scientific	VetFlo-1210S	Preparazione alla chirurgia

di supporto per la testa attiva di contenimento di supporto per la testa di supporto per la testa di supporto per la testa