Analisi della dinamica del calcio e delle variazioni del potenziale di membrana in un endotelio arteriolare di topo

Abstract

Fonte: Hakim, M. A. et al., Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale di topo. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra l'analisi funzionale di un tubo endoteliale arteriolare isolato da un cervello di topo. Delinea i passaggi per misurare i livelli intracellulari di calcio e il potenziale di membrana, sia al basale che in risposta alla stimolazione farmacologica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Materiali e attrezzature

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per tutti i reagenti e i materiali necessari per questo protocollo. Inoltre, se necessario, è possibile consultare anche manuali e siti Web associati ai rispettivi fornitori.

1. Camera di flusso
   1. Fissare una camera di superfusione con un vetrino coprioggetti su una piattaforma composta da alluminio anodizzato. Fissare la piattaforma con la camera su un tavolino per microscopio in alluminio.
   2. Posizionare un micromanipolatore che tiene una pipetta di spillatura a ciascuna estremità della piattaforma sul tavolino del microscopio in alluminio.
      NOTA: Se necessario, utilizzare un apparato di stadio trasferibile con un'unità di camera di flusso per spostare un tubo endoteliale isolato e protetto da un apparecchio di microscopio all'altro per la sperimentazione.
2. Microscopi
   1. Configura l'apparato sperimentale disponendo un microscopio invertito (obiettivi: 4x, 10x, 20x, 40x e 60x) e un tavolino manuale in alluminio su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni.
3. V_m apparecchiature di registrazione
   1. Collegare l'elettrometro a un headstage compatibile. Utilizzare accessori, come un generatore di funzioni e uno stimolatore, per i protocolli che richiedono l'iniezione di corrente.
   2. Collegare le uscite dell'amplificatore a un sistema di digitalizzazione dei dati, all'oscilloscopio e ai monitor di base acustici. Fissare l'elettrodo del bagno di riferimento (pellet Ag/AgCl) vicino all'uscita della camera di flusso.
   3. Assemblare un sistema fotometrico con componenti integrati di un'interfaccia per sistema a fluorescenza, una lampada ad arco ad alta intensità e un alimentatore, un hyperswitch, un tubo fotomoltiplicatore (o PMT) e una fotocamera per misurare [Ca²⁺]_i in cellule endoteliali.
   4. Assemblare un termoregolatore dotato di un riscaldatore in linea per aumentare e mantenere una temperatura fisiologica (37 °C) durante l'esperimento.
   5. Assemblare una piattaforma multicanale collegata a un controller di valvole con una valvola di controllo del flusso in linea per controllare l'erogazione di soluzioni ai tubi endoteliali fissati nella camera.
4. Micropipette ed elettrodi affilati
   NOTA: Lo sperimentatore avrà bisogno di un estrattore elettronico di vetro e di una microforgia per preparare le pipette di fissaggio.
   1. Per fissare il tubo endoteliale nella camera di superfusione, preparare pipette di spillatura lucidate a caldo con un'estremità smussata e sferica (diametro esterno: 50-70 μm) preparate da capillari di vetro borosilicato a parete sottile.
   2. Per registrare il V_m di una cellula endoteliale, preparare elettrodi affilati con una resistenza della punta di ~150 ± 30 MΩ dai capillari di vetro utilizzando solo l'estrattore di vetro.

2. Soluzioni e farmaci

1. Soluzione salina fisiologica (PSS)
   1. Preparare un minimo di 1 L di PSS utilizzando 140 mM di NaCl, 5 mM di KCl, 2 mM di CaCl₂, 1 mM di MgCl₂, 10mM N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-acido etansolfonico (HEPES) e 10 mM di glucosio.
   2. Preparare le soluzioni necessarie prive di CaCl₂ (zero Ca²⁺ PSS) per la dissezione delle arteriole cerebrali e l'isolamento dei tubi endoteliali.
      NOTA: Preparare tutte le soluzioni in H₂O, seguita da filtrazione (0,22 μm). Assicurarsi che il prodotto finale contenga un pH 7,4 con osmolalità compresa tra 290 e 300 mOsm.
2. Fura-2 e agenti farmacologici
   1. Preparare il brodo Fura-2 AM in dimetilsolfossido (DMSO; 1 mM). Preparare 500 μl di concentrazione di lavoro (10 μM) aggiungendo 5 μl di materiale grezzo a 495 μl di PSS per il caricamento.
   2. Preparare almeno 50 mL di concentrazioni di lavoro di agenti farmacologici in PSS o DMSO, a seconda dei casi.
3. Soluzione conduttrice
   1. Preparare 2 M di KCl sciogliendo KCl in H₂O (7,455 g di KCl in 50 mL di H₂O). Passare la soluzione attraverso una siringa con un filtro da 0,22 μm prima di riempire nuovamente gli elettrodi affilati.

3. Utilizzo di tubi endoteliali arteriolari per l'esame della fisiologia cellulare

NOTA: I tubi endoteliali arteriolari isolati e protetti possono essere utilizzati per registrazioni intracellulari di [Ca²⁺]_idinamica e V_m utilizzando rispettivamente la fotometria e l'elettrofisiologia degli elettrodi affilati, come precedentemente illustrato (Figura 1). [Ca²⁺]_i e V_m possono essere misurati come variabili sperimentali separate o combinate (Figura 1). Tuttavia, i tubi endoteliali arteriolari sono più delicati dell'endotelio arterioso e il tempo di sperimentazione non deve superare 1 ora.

1. Misurazione di [Ca²⁺]_i
   1. Accendere l'apparecchiatura e il software per le registrazioni [Ca²⁺]_i mantenendo la superfusione continua a una velocità di flusso di 5-7 mL/min.
   2. Caricare il tubo endoteliale con il Ca²⁺ colorare Fura-2 AM per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle con soluzione superfusionale per altri 20-30 minuti, aumentando gradualmente la temperatura del bagno a 37 °C. Mantenere la temperatura a 37 °C per tutta la durata dell'esperimento.
   3. Regolare manualmente la finestra di imaging utilizzando il software di fotometria per mettere a fuoco ~20 cellule endoteliali (Figura 1A). In assenza di luce, accendere il PMT sull'interfaccia di fluorescenza e iniziare l'acquisizione di [Ca²⁺]_i eccitando Fura-2 alternativamente (≥10 Hz) a 340 nm e 380 nm mentre raccoglie l'emissione di fluorescenza a 510 nm. Una volta stabilita una registrazione di base stabile di [Ca²⁺]_i, applicare agenti farmacologici (ad esempio, agonisti del recettore purinergico) secondo l'obiettivo sperimentale (Figura 1B).
2. Misurazione di V_m
   1. Accendere l'apparecchiatura e il software per le registrazioni V_m e impostare la velocità di acquisizione dei dati (≥10 Hz) mantenendo la superfusione continua a una velocità di flusso di 5-7 mL/min. Aumentare gradualmente la temperatura del bagno a 37 °C e mantenerla fino alla fine dell'esperimento.
   2. Estrarre un elettrodo affilato utilizzando un capillare in vetro borosilicato, riempire con 2 M KCl e fissarlo su un filo d'argento rivestito di cloruro nel portapipette collegato a un elettrometro che, a sua volta, è tenuto da un micromanipolatore.
   3. Durante la visualizzazione attraverso l'obiettivo 4x, utilizzare un micromanipolatore per posizionare con cura la punta affilata dell'elettrodo appena sopra una cellula del tubo endoteliale arteriolare nel PSS che scorre nella camera.
   4. Aumentare gradualmente l'ingrandimento fino a 400x e riposizionare la punta dell'elettrodo secondo necessità.
   5. Utilizzando il micromanipolatore, inserire delicatamente la punta di un elettrodo affilato in una delle cellule del tubo endoteliale e iniziare a registrare V_m utilizzando un elettrometro (Figura 1A}).

Una volta che il V_m è stabile (da -30 a -40 mV), applicare gli agenti farmacologici desiderati per obiettivo sperimentale (Figura 1C}).

Risultati

Figura 1: Applicazione del tubo endoteliale per l'esame fisiologico delle vie correlate alla regolazione del flusso sanguigno. (A) Un elettrodo affilato (freccia viola) è posizionato in una cella di un tubo endoteliale focalizzato nella finestra di acquisizione dati per la fotometria. (B) Registrazione rappresentativa di Ca²⁺ intracellulare utilizzando la fo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitora	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Refrigeratore da bagno (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Capillari in vetro borosilicato (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Capillari in vetro borosilicato (Elettrodi affilati)	Warner Instruments	GC100F-10
BSA: Siero Bovino Albumina	Sigma	A7906
CaCl2: Cloruro di Calcio	Sigma	223506
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Valvola di controllo del flusso	Warner Instruments	FR-50
Interfaccia del sistema di fluorescenza, lampada ARC e alimentatore, hyperswitch e PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Function Generator	EZ Digital, Seoul, Corea del Sud	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucosio	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Acido cloridrico	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico)	Sigma	H4034
Riscaldatore di Soluzione in Linea	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Cloruro di Potassio	Sigma	P9541
MgCl2: Cloruro di Magnesio	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipolatore	Siskiyou	MX10
Estrattore per micropipette (digitale)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 o P-1000
Microscopio (Nikon-invertito)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Microscopio ( Nikon	Instruments Inc	Eclipse TS100
Obiettivi per microscopio	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) e 40X (Plan Fluor)
Piattaforma per microscopio (alluminio anodizzato; diametro, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 o PH6
Tavolino per microscopio (alluminio)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt	Tocris	1624
NaCl: Cloruro di Sodio	Sigma	S7653
NaOH: Idrossido di Sodio	Sigma	S8045
Oscilloscopio	Tektronix, Beaverton, Oregon, Stati Uniti	d'America TDS 2024B
Obiettivi a contrasto di fase	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Camera di superfusione in plexiglas	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Stereomicroscopi	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Filtro siringa (0.22 μm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Regolatore di temperatura (doppio canale)	Warner Instruments	TC-344B o C
Sistema di controllo delle valvole	Warner Instruments	VC-6
Tabella di isolamento dalle vibrazioni	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g