Analisi della dinamica del calcio e delle variazioni del potenziale di membrana in un endotelio arteriolare di topo

Abstract

Fonte: Hakim, M. A. et al., Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale di topo. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra l'analisi funzionale di un tubo endoteliale arteriolare isolato da un cervello di topo. Delinea i passaggi per misurare i livelli intracellulari di calcio e il potenziale di membrana, sia al basale che in risposta alla stimolazione farmacologica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

Risultati

Figura 1: Applicazione del tubo endoteliale per l'esame fisiologico delle vie correlate alla regolazione del flusso sanguigno. (A) Un elettrodo affilato (freccia viola) è posizionato in una cella di un tubo endoteliale focalizzato nella finestra di acquisizione dati per la fotometria. (B) Registrazione rappresentativa di Ca²⁺ intracellulare utilizzando la fo.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitora	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Refrigeratore da bagno (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Capillari in vetro borosilicato (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Capillari in vetro borosilicato (Elettrodi affilati)	Warner Instruments	GC100F-10
BSA: Siero Bovino Albumina	Sigma	A7906
CaCl2: Cloruro di Calcio	Sigma	223506
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Valvola di controllo del flusso	Warner Instruments	FR-50
Interfaccia del sistema di fluorescenza, lampada ARC e alimentatore, hyperswitch e PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Function Generator	EZ Digital, Seoul, Corea del Sud	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucosio	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Acido cloridrico	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico)	Sigma	H4034
Riscaldatore di Soluzione in Linea	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Cloruro di Potassio	Sigma	P9541
MgCl2: Cloruro di Magnesio	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipolatore	Siskiyou	MX10
Estrattore per micropipette (digitale)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 o P-1000
Microscopio (Nikon-invertito)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Microscopio ( Nikon	Instruments Inc	Eclipse TS100
Obiettivi per microscopio	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) e 40X (Plan Fluor)
Piattaforma per microscopio (alluminio anodizzato; diametro, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 o PH6
Tavolino per microscopio (alluminio)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt	Tocris	1624
NaCl: Cloruro di Sodio	Sigma	S7653
NaOH: Idrossido di Sodio	Sigma	S8045
Oscilloscopio	Tektronix, Beaverton, Oregon, Stati Uniti	d'America TDS 2024B
Obiettivi a contrasto di fase	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Camera di superfusione in plexiglas	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Stereomicroscopi	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Filtro siringa (0.22 μm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Regolatore di temperatura (doppio canale)	Warner Instruments	TC-344B o C
Sistema di controllo delle valvole	Warner Instruments	VC-6
Tabella di isolamento dalle vibrazioni	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g