Analisi della dinamica del calcio e delle variazioni del potenziale di membrana in un endotelio arteriolare di topo

Abstract

Fonte: Hakim, M. A. et al., Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale di topo. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra l'analisi funzionale di un tubo endoteliale arteriolare isolato da un cervello di topo. Delinea i passaggi per misurare i livelli intracellulari di calcio e il potenziale di membrana, sia al basale che in risposta alla stimolazione farmacologica.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Materiali e attrezzature

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per tutti i reagenti e i materiali necessari per questo protocollo. Inoltre, se necessario, è possibile consultare anche manuali e siti Web associati ai rispettivi fornitori.

1. Camera di flusso
   1. Fissare una camera di superfusione con un vetrino coprioggetti su una piattaforma composta da alluminio anodizzato. Fissare la piattaforma con la camera su un tavolino per microscopio in alluminio.
   2. Posizionare un micromanipolatore che tiene una pipetta di spillatura a ciascuna estremità della piattaforma sul tavolino del microscopio in alluminio.
      NOTA: Se necessario, utilizzare un apparato di stadio trasferibile con un'unità di camera di flusso per spostare un tubo endoteliale isolato e protetto da un apparecchio di microscopio all'altro per la sperimentazione.
2. Microscopi
   1. Configura l'apparato sperimentale disponendo un microscopio invertito (obiettivi: 4x, 10x, 20x, 40x e 60x) e un tavolino manuale in alluminio su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni.
3. V_m apparecchiature di registrazione
   1. Collegare l'elettrometro a un headstage compatibile. Utilizzare accessori, come un generatore di funzioni e uno stimolatore, per i protocolli che richiedono l'iniezione di corrente.
   2. Collegare le uscite dell'amplificatore a un sistema di digitalizzazione dei dati, all'oscilloscopio e ai monitor di base acustici. Fissare l'elettrodo del bagno di riferimento (pellet Ag/AgCl) vicino all'uscita della camera di flusso.
   3. Assemblare un sistema fotometrico con componenti integrati di un'interfaccia per sistema a fluorescenza, una lampada ad arco ad alta intensità e un alimentatore, un hyperswitch, un tubo fotomoltiplicatore (o PMT) e una fotocamera per misurare [Ca²⁺]_i in cellule endoteliali.
   4. Assemblare un termoregolatore dotato di un riscaldatore in linea per aumentare e mantenere una temperatura fisiologica (37 °C) durante l'esperimento.
   5. Assemblare una piattaforma multicanale collegata a un controller di valvole con una valvola di controllo del flusso in linea per controllare l'erogazione di soluzioni ai tubi endoteliali fissati nella camera.
4. Micropipette ed elettrodi affilati
   NOTA: Lo sperimentatore avrà bisogno di un estrattore elettronico di vetro e di una microforgia per preparare le pipette di fissaggio.
   1. Per fissare il tubo endoteliale nella camera di superfusione, preparare pipette di spillatura lucidate a caldo con un'estremità smussata e sferica (diametro esterno: 50-70 μm) preparate da capillari di vetro borosilicato a parete sottile.
   2. Per registrare il V_m di una cellula endoteliale, preparare elettrodi affilati con una resistenza della punta di ~150 ± 30 MΩ dai capillari di vetro utilizzando solo l'estrattore di vetro.

2. Soluzioni e farmaci

1. Soluzione salina fisiologica (PSS)
   1. Preparare un minimo di 1 L di PSS utilizzando 140 mM di NaCl, 5 mM di KCl, 2 mM di CaCl₂, 1 mM di MgCl₂, 10mM N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-acido etansolfonico (HEPES) e 10 mM di glucosio.
   2. Preparare le soluzioni necessarie prive di CaCl₂ (zero Ca²⁺ PSS) per la dissezione delle arteriole cerebrali e l'isolamento dei tubi endoteliali.
      NOTA: Preparare tutte le soluzioni in H₂O, seguita da filtrazione (0,22 μm). Assicurarsi che il prodotto finale contenga un pH 7,4 con osmolalità compresa tra 290 e 300 mOsm.
2. Fura-2 e agenti farmacologici
   1. Preparare il brodo Fura-2 AM in dimetilsolfossido (DMSO; 1 mM). Preparare 500 μl di concentrazione di lavoro (10 μM) aggiungendo 5 μl di materiale grezzo a 495 μl di PSS per il caricamento.
   2. Preparare almeno 50 mL di concentrazioni di lavoro di agenti farmacologici in PSS o DMSO, a seconda dei casi.
3. Soluzione conduttrice
   1. Preparare 2 M di KCl sciogliendo KCl in H₂O (7,455 g di KCl in 50 mL di H₂O). Passare la soluzione attraverso una siringa con un filtro da 0,22 μm prima di riempire nuovamente gli elettrodi affilati.

3. Utilizzo di tubi endoteliali arteriolari per l'esame della fisiologia cellulare

NOTA: I tubi endoteliali arteriolari isolati e protetti possono essere utilizzati per registrazioni intracellulari di [Ca²⁺]_idinamica e V_m utilizzando rispettivamente la fotometria e l'elettrofisiologia degli elettrodi affilati, come precedentemente illustrato (Figura 1). [Ca²⁺]_i e V_m possono essere misurati come variabili sperimentali separate o combinate (Figura 1). Tuttavia, i tubi endoteliali arteriolari sono più delicati dell'endotelio arterioso e il tempo di sperimentazione non deve superare 1 ora.

1. Misurazione di [Ca²⁺]_i
   1. Accendere l'apparecchiatura e il software per le registrazioni [Ca²⁺]_i mantenendo la superfusione continua a una velocità di flusso di 5-7 mL/min.
   2. Caricare il tubo endoteliale con il Ca²⁺ colorare Fura-2 AM per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle con soluzione superfusionale per altri 20-30 minuti, aumentando gradualmente la temperatura del bagno a 37 °C. Mantenere la temperatura a 37 °C per tutta la durata dell'esperimento.
   3. Regolare manualmente la finestra di imaging utilizzando il software di fotometria per mettere a fuoco ~20 cellule endoteliali (Figura 1A). In assenza di luce, accendere il PMT sull'interfaccia di fluorescenza e iniziare l'acquisizione di [Ca²⁺]_i eccitando Fura-2 alternativamente (≥10 Hz) a 340 nm e 380 nm mentre raccoglie l'emissione di fluorescenza a 510 nm. Una volta stabilita una registrazione di base stabile di [Ca²⁺]_i, applicare agenti farmacologici (ad esempio, agonisti del recettore purinergico) secondo l'obiettivo sperimentale (Figura 1B).
2. Misurazione di V_m
   1. Accendere l'apparecchiatura e il software per le registrazioni V_m e impostare la velocità di acquisizione dei dati (≥10 Hz) mantenendo la superfusione continua a una velocità di flusso di 5-7 mL/min. Aumentare gradualmente la temperatura del bagno a 37 °C e mantenerla fino alla fine dell'esperimento.
   2. Estrarre un elettrodo affilato utilizzando un capillare in vetro borosilicato, riempire con 2 M KCl e fissarlo su un filo d'argento rivestito di cloruro nel portapipette collegato a un elettrometro che, a sua volta, è tenuto da un micromanipolatore.
   3. Durante la visualizzazione attraverso l'obiettivo 4x, utilizzare un micromanipolatore per posizionare con cura la punta affilata dell'elettrodo appena sopra una cellula del tubo endoteliale arteriolare nel PSS che scorre nella camera.
   4. Aumentare gradualmente l'ingrandimento fino a 400x e riposizionare la punta dell'elettrodo secondo necessità.
   5. Utilizzando il micromanipolatore, inserire delicatamente la punta di un elettrodo affilato in una delle cellule del tubo endoteliale e iniziare a registrare V_m utilizzando un elettrometro (Figura 1A}).

Una volta che il V_m è stabile (da -30 a -40 mV), applicare gli agenti farmacologici desiderati per obiettivo sperimentale (Figura 1C}).

Results

Figura 1: Applicazione del tubo endoteliale per l'esame fisiologico delle vie correlate alla regolazione del flusso sanguigno. (A) Un elettrodo affilato (freccia viola) è posizionato in una cella di un tubo endoteliale focalizzato nella finestra di acquisizione dati per la fotometria. (B) Registrazione rappresentativa di Ca²⁺ intracellulare utilizzando la fo...

Materials