Valutazione dei livelli di neurotrasmettitori eccitatori nei ratti indotti da epilessia cronica

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

Questo protocollo è specificamente regolato per la determinazione del glutammato e dell'aspartato nei dializzati cerebrali di ratto ottenuti sotto controllo EEG di sessioni di microdialisi in ratti epilettici e non epilettici. Molti dei materiali qui descritti possono essere facilmente sostituiti con quelli che si utilizzano nel proprio laboratorio per registrazioni EEG o microdialisi.

1. Assemblaggio del dispositivo sonda-elettrodo per microdialisi

1. Utilizzare un elettrodo a 3 canali a due torsioni (con almeno 20 mm di lunghezza di taglio dell'elettrodo di registrazione e un elettrodo di messa a terra lungo 10 cm) e accoppiarlo a una cannula guida per preparare il dispositivo. Vedere esempi di elettrodo a 3 canali e cannula guida per dialisi nella Figura 1A-1B.
2. Rimuovere (Figura 1C) e inserire (Figura 1D) la cannula guida in metallo nella cannula di plastica fittizia alcune volte prima dell'uso per facilitarne la rimozione al momento dell'interruttore per la sonda per microdialisi nell'animale.
3. Piegare due volte i fili intrecciati dell'elettrodo di registrazione (Figura 1E-1F) per allineare i fili con la cannula cieca della guida e tagliare la punta dell'elettrodo (Figura 1G) in modo che sia più lunga di 0,5 mm rispetto alla punta della cannula guida (Figura 1H) utilizzando il calibro digitale.
4. Avere a portata di mano il cerchietto di silicone lungo 1 mm (D.E. 2 mm, spessore 0,3 mm; Figura 1I) e inserire la punta della cannula guida e la punta degli elettrodi attorcigliati nel cerchietto di silicone utilizzando le pinzette (Figura 1J). Fissarlo sul piede del piedistallo della cannula guida con colla polimerica ad azione rapida o resina (Figura 1K). Vedere l'esempio dei dispositivi completati nella Figura 1L e nella Figura 2A.
5. Sterilizzare il dispositivo sotto la luce UV germicida per 4 ore. Capovolgere il dispositivo quattro volte in modo che ciascuno dei suoi lati sia esposto alla luce per 1 ora
   Nota: molti elettrodi fatti in casa e sonde per microdialisi possono essere assemblati in modo simile. La testa dell'impianto per ratti sopra descritto ha le seguenti dimensioni: 7 mm di larghezza x 5 mm di profondità x 10 mm di lunghezza dalla cima al piedistallo; La punta dell'impianto è lunga circa 11 mm, ha un diametro di 600 μm e tutto il dispositivo pesa circa 330-360 mg. Il dispositivo può essere riutilizzato due o tre volte se i) durante l'intervento chirurgico viene lasciata sul cranio una lunghezza sufficiente dell'elettrodo di terra per l'uso successivo e ii) quando l'animale viene ucciso e il dispositivo recuperato insieme al cemento dentale viene lasciato in acetone per una notte, in modo che il cemento possa essere disaggregato meccanicamente, e il dispositivo è stato nuovamente lavato e sterilizzato.

2. Chirurgia stereotassica

1. Utilizzare un apparecchio stereotassico e un supporto per clip per sonda (Figura 2B) per l'impianto del dispositivo seguendo gli standard contemporanei per gli interventi chirurgici asettici e indolori.
   1. Anestetizzare i ratti adulti di Sprague-Dawley con una miscela di ketamina/xilazina (43 mg/kg e 7 mg/kg, i.p.) e fissarla sul telaio stereotassico. Aggiungere l'anestesia con isoflurano (1,4% in aria; 1,2 ml/min) all'iniezione iniziale di ketamina/xilazina in quanto consente di controllare la profondità dell'anestesia nel tempo. Rasare il pelo sulla testa dell'animale.
2. Tamponare la superficie della pelle della testa con una soluzione a base di iodio seguita da etanolo al 70% per prepararla alla chirurgia asettica.
   1. Impianta il dispositivo cannula-elettrodo guida preparato in precedenza (1.1 – 1.5) nell'ippocampo ventrale destro utilizzando le seguenti coordinate: barra nasale + 5.0 mm, A – 3.4 mm, L + 4.5 mm, P + 6.5 mm a bregma. Seguire le tecniche standard per gli interventi chirurgici stereotassici.
   2. Assicurarsi che non copra le viti di ancoraggio. Quando lo si monta sull'apparecchio stereotassico, afferrare il dispositivo per la testa della cannula di guida in quanto può essere facilmente allineata al supporto della sonda.
3. Ancorare il dispositivo al cranio con almeno quattro viti inossidabili avvitandole nell'osso del cranio (1 vite nella sinistra e 1 vite nelle placche ossee frontali destre, 1 vite nel parietale sinistro e 1 vite nelle placche ossee interparietali). Aggiungi una goccia di colla per tessuti per fissare ulteriormente ogni vite all'osso del cranio.
   1. Copri metà delle filettature delle viti con cemento metacrilico. Favorire il legame del cemento praticando solchi poco profondi nell'osso per aumentare l'aderenza.
4. Una volta che la punta del dispositivo è posizionata nel tessuto cerebrale, attorcigliare il filo dell'elettrodo di terra attorno a 3 viti di ancoraggio. Coprire tutte le viti montate e il dispositivo con il cemento dentale.
5. Monitorare gli animali durante l'intervento chirurgico e per circa 1 ora dopo fino a quando non si alzano e si muovono intorno alla gabbia. Tienili su un tappetino riscaldante per evitare l'ipotermia. Lasciare che i ratti si riprendano per almeno 7 giorni dopo l'impianto del dispositivo.
6. Monitorare gli animali almeno una volta al giorno per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per segni di dolore o angoscia. Somministrare agli animali la crema antibiotica (gentamicina 0,1%) vicino al sito inciso per prevenire l'infezione e un analgesico (tramadolo 5 mg/kg, intraperitoneale [i.p.]) per 3 giorni per prevenire il dolore post-operatorio.

3. Induzione dell'epilessia del lobo temporale da parte della pilocarpina e assegnazione degli animali a gruppi sperimentali

1. Dopo una settimana di recupero post-chirurgico, assegnare gli animali in modo casuale ai gruppi: (i) animali di controllo che ricevono il veicolo e (ii) animali epilettici che riceveranno pilocarpina. Utilizzare un numero proporzionalmente più alto di animali per il gruppo epilettico poiché non tutti i ratti somministrati con pilocarpina svilupperanno la malattia.
2. Iniettare una dose di metilscopolamina (1 mg/kg, per via sottocutanea [s.c.]) e 30 minuti dopo, una singola iniezione di pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) per indurre lo stato epilettico (SE). Iniettare metilscopolamina e il veicolo (soluzione fisiologica) nei ratti di controllo. Utilizzare una siringa da 1 ml con ago da 25 G per tutte le somministrazioni i.p.
   1. Controlla visivamente gli animali per iniziare ad avere crisi comportamentali (muovere la vibrissa entro 5 minuti, annuire con la testa, clonare gli arti) ed entro 25 minuti per clonare continuamente tutto il corpo (SE).
3. Arrestare l'SE 2 ore dopo l'esordio per avere una mortalità di circa il 25% e un periodo medio di latenza di circa 10 giorni mediante somministrazione di diazepam (20 mg/kg, i.p.). Osservare e registrare qualsiasi comportamento convulsivo a partire immediatamente dopo l'iniezione di pilocarpina e continuare per almeno 6 ore successive.
4. Somministrare agli animali soluzione fisiologica (1 ml, i.p.) utilizzando una siringa da 1 ml con ago da 25 G e soluzione di saccarosio (1 ml, per os [p.o.]) utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 17 G con alimentazione flessibile per 2-3 giorni dopo l'SE per favorire il recupero della perdita di peso corporeo.
   1. Escludi dallo studio gli animali che non raggiungono il peso corporeo iniziale entro la prima settimana dopo la pilocarpina SE (ad eccezione del gruppo acuto ucciso 24 ore dopo SE, dove il follow-up del peso corporeo non è possibile).
5. Assegnare gli animali post-SE in modo casuale a diversi gruppi sperimentali (Figura 3): fase acuta (in cui la microdialisi avviene 24 ore dopo SE), latenza (7-9 giorni dopo SE), prima crisi spontanea (circa 11 giorni dopo SE) e ciclo cronico (inizia circa 22-24 giorni dopo SE, cioè circa 10 giorni dopo la prima crisi). Monitorare gli animali per l'insorgenza di convulsioni spontanee.
   NOTA: Utilizzare i seguenti criteri di inclusione/esclusione per ulteriori esperimenti nei ratti epilettici: sviluppo di SE convulsivo entro 1 ora dalla somministrazione di pilocarpina; aumento di peso nella prima settimana dopo l'SE e il corretto posizionamento della sonda e dell'elettrodo per microdialisi.

4. Monitoraggio e analisi del comportamento epilettico

1. Monitoraggio a lungo termine del comportamento epilettico
   1. Circa 6 ore dopo la somministrazione di pilocarpina (cioè, al termine dell'osservazione diretta da parte dei ricercatori), posizionare gli animali nelle gabbie domestiche pulite e avviare il monitoraggio video 24 ore su 24.
   2. Continua il monitoraggio video 24 ore su 24 fino al giorno 5, utilizzando un sistema di videosorveglianza digitale.
   3. A partire dal quinto giorno, collegare i ratti nelle loro gabbie rettangolari domestiche al sistema di registrazione EEG collegato e continuare il monitoraggio video 24 ore su 24.
   4. Impostare i parametri sull'amplificatore posizionato all'esterno della gabbia di Faraday (impostare il fattore di amplificazione su ogni canale in base alla specificità del segnale EEG di ogni singolo animale) e avviare l'acquisizione EEG osservando il segnale EEG prodotto da cavi non collegati. Utilizzare la frequenza di campionamento di 200 Hz e il filtro passa-basso impostato su 0,5 Hz.
   5. Collegare l'animale ai cavi, tenendo la testa di un animale tra due dita tese di una mano e avvitando i connettori al piedistallo dell'elettrodo usando l'altra mano libera. Avviare l'acquisizione.
      ATTENZIONE: Assicurarsi che il segnale sia privo di artefatti. Gli artefatti comuni sono le punte che superano di gran lunga la scala.
   6. Un giorno prima dell'esperimento di microdialisi, trasferire gli animali nel sistema EEG legato dotato di cilindri in plexiglass per la microdialisi. Scollegare gli animali dal sistema di tethering EEG nella gabbia domestica avvitando i connettori dall'elettrodo senza trattenere l'animale. Posizionare l'animale nei cilindri alti in plexiglass.
2. Monitoraggio del comportamento epilettico un giorno prima e durante la sessione di microdialisi
   1. Accendere l'amplificatore posizionato all'esterno della gabbia di Faraday. Aprire il software EEG. Avviare l'acquisizione EEG osservando il segnale EEG prodotto da cavi non collegati.
   2. Collegare l'animale al sistema di registrazione EEG collegato tenendo la testa di un animale tra due dita tese di una mano e avvitando i connettori al piedistallo dell'elettrodo usando l'altra mano libera. Impostare un fattore di amplificazione (guadagno) su ciascun canale dell'amplificatore in base al segnale dell'elettrodo del singolo animale in modo che il segnale EEG sia in scala. Lasciare che l'animale esplori la nuova gabbia (cilindro) per almeno 1 ora sotto l'osservazione diretta del ricercatore.
   3. NOTA: 24 ore prima dell'esperimento di microdialisi, i ratti vengono brevemente anestetizzati con isoflurano per il passaggio delle cannule guida alla sonda di microdialisi. Approfitta del momento in cui vengono anestetizzati per collegarli al sistema di registrazione EEG.
   4. Accorciare o prolungare il cavo pendulo in base alla merce dell'animale. Assicurarsi che i cavi non interferiscano con i movimenti dell'animale e la postura sdraiata.
   5. Verificare la corretta inquadratura dell'immagine delle videocamere. Avviare la registrazione video-EEG.
3. Identificazione delle convulsioni e dell'attività EEG
   1. Usa un lettore software per guardare i video. Scorri il filmato 8 volte più velocemente rispetto alla riproduzione in tempo reale e individua le convulsioni generalizzate (vedi animale da allevare con clono degli arti anteriori o allevamento e caduta degli animali con clono degli arti anteriori). Rallenta il video e annota l'orario preciso dell'inizio e della fine della crisi comportamentale.
   2. Elaborare i dati contando il numero di crisi generalizzate osservate in 24 ore di registrazioni video ed esprimerli in termini di frequenza e durata delle crisi come valori medi di tutte le crisi osservate in 24 ore.
   3. Definire le crisi EEG come i periodi di attività parossistica ad alta frequenza (>5 Hz) caratterizzati da un incremento di ampiezza di >3 volte rispetto al basale con progressione della frequenza di picco che dura per un minimo di 3 s o simili. Utilizzare il software EEG per elaborare le registrazioni EEG grezze. Suddividere le tracce EEG in frazioni di 1 ora. Copia le frazioni di tracciato EEG su file per l'analisi automatica dei picchi del software.
   4. Analizzare i dati dell'attività EEG utilizzando il software EEG e i parametri predefiniti (4.3.3.). Conduci tutte le analisi video in due investigatori indipendenti che sono all'oscuro del gruppo di animali analizzati. In caso di divergenza, fai in modo che riesaminino i dati insieme per raggiungere un consenso.

5. Microdialisi

1. Recupero della sondain vitro
   1. Preparare la sonda per il suo primo utilizzo secondo le istruzioni del produttore, maneggiandola nella sua custodia protettiva.
   2. Eseguire l'esperimento in triplicato: preparare tre provette da 1,5 mL caricandole con 1 mL di soluzione di Ringer contenente la miscela di standard (2,5 μM di glutammato e 2,5 μM di aspartato). Inserire tre provette caricate da 1,5 mL nel riscaldatore a blocchi impostato a 37 °C e posizionarlo sull'agitatore.
      NOTA: Utilizzare le stesse soluzioni standard per le calibrazioni cromatografiche.
   3. Sigillare le provette da 1,5 ml con pellicola di paraffina e forarle con una pinzetta affilata per praticare un foro di circa 1 mm di diametro.
   4. Prendere la sonda e inserirla nel foro praticato in pellicola di paraffina. Immergere la membrana almeno 2 mm sotto il livello della soluzione. Fissare ulteriormente la sonda a una provetta da 1,5 ml con una pellicola di paraffina.
      ATTENZIONE: Assicurarsi che la punta non tocchi le pareti della provetta da 1,5 ml.
   5. Collegare l'ingresso della sonda alla siringa montata sulla pompa di infusione utilizzando tubi fluorurati etilene propilene (FEP) - tubi e adattatori per tubi. Facoltativamente, utilizzare tubi in polietilene a foro fine con diametro interno (ID) e diametro esterno (OD) di 0,61 mm e adattatori per tubi colorati (adattatori per tubi rossi e blu) per i collegamenti.
   6. Avviare la pompa a 2 μl/min e lasciare che il fluido appaia sulla punta di uscita. Collegare l'uscita della sonda alla provetta di raccolta da 0,2 ml utilizzando tubi FEP e adattatori per tubi.
      NOTA: Utilizzare tubi FEP per tutti i collegamenti. Tagliare la lunghezza desiderata del tubo utilizzando una lama di rasoio. Utilizzare adattatori per tubi di colore diverso per l'ingresso e l'uscita della sonda. Lasciare in funzione la pompa per 60 minuti. Verificare la presenza di perdite e bolle d'aria. Questi non dovrebbero essere presenti.
   7. Impostare la pompa sulla portata di 2 μL/min e iniziare a raccogliere i campioni sul lato di uscita del tubo.
   8. Raccogliere tre campioni di perfusato da 30 minuti e tre campioni di uguale volume della soluzione nella provetta da 1,5 mL. Prelevare campioni di uguale volume dalla provetta da 1,5 ml ogni 30 minuti utilizzando la microsiringa immersa nella soluzione standard nella provetta da 1,5 ml.
   9. Ripetere l'esperimento (5.1.1-5.1.8) impostando la pompa alla portata di 3 μL/min (5.1.7) per avere un confronto del recupero della sonda quando si utilizzano due diverse portate di perfusione.
   10. Al termine, arrestare la pompa e sciacquare il tubo con acqua distillata, etanolo al 70% e spingere l'aria al suo interno. Conservare la sonda in una fiala piena di acqua distillata pulita. Sciacquare accuratamente la sonda perfondendola a 2 μL/min con acqua distillata prima di riporla.
   11. Analizzare la concentrazione del glutammato e dell'aspartato nei campioni mediante cromatografia.
   12. Calcolare il recupero utilizzando la seguente equazione:
       Recupero (%) = (C_perfusato /C_{soluzione dialisa}) x 100.
2. Sessioni di microdialisi in ratti che si muovono liberamente
   1. Procedure preparative: inserimento e test della sonda, impostazione e avvio della pompa di infusione
      1. Prepara le sonde di microdialisi per il primo utilizzo secondo la guida per l'utente del produttore e riempile con la soluzione di Ringer. Tagliare pezzi di tubo FEP lunghi circa 10 cm e collegarli alle cannule di ingresso e uscita della sonda utilizzando gli adattatori per tubi di diversi colori.
      2. Assicurarsi che il tubo tocchi gli adattatori senza spazi morti in tutti i collegamenti.
      3. 24 ore prima dell'esperimento di microdialisi, anestetizzare brevemente l'animale con isoflurano (5% nell'aria) in una camera di induzione fino a quando non è sdraiato. Rimuovi la cannula fittizia dalla sua guida usando le pinzette e tenendo saldamente la testa dell'animale. Inserire la sonda per microdialisi, dotata di membrana dializzante, nella cannula guida e rassodare ulteriormente le cannule per microdialisi inserite nella loro guida modellando l'argilla.
         ATTENZIONE: Non lasciare che la sonda tocchi le pareti del manicotto protettivo della sonda durante l'estrazione.
      4. Metti l'animale nel cilindro di plexiglass e lascialo esplorare il nuovo ambiente. Collegare l'animale al sistema di registrazione EEG collegato come descritto sopra (seguire i punti 4.2.2 e 4.2.3).
      5. Segui i movimenti del ratto sveglio e in movimento libero e collega l'ingresso della sonda alla siringa da 2,5 ml con ago 22G smussato contenente la soluzione di Ringer utilizzando gli adattatori per tubi. Spingere la soluzione di Ringer all'interno della sonda espellendo 1 mL di soluzione di Ringer in 10 s spingendo continuamente il pistone della siringa da 2,5 mL. Verificare la presenza di gocce di liquido sulla presa. La sonda è ora pronta per l'uso.
      6. Riempire le siringhe da 2,5 mL collegate al tubo FEP tramite adattatori per tubi con la soluzione di Ringer e montarle sulla pompa per infusione. Avviare la pompa a 2 μl/min. Lascialo funzionare durante la notte.
         NOTA: Utilizzare la lunghezza desiderata di tutti i tubi FEP, ma calcolare il volume morto del tubo per sapere quando deve essere avviata l'elevata stimolazione K⁺ e per correlare i dati di quantificazione con i cambiamenti neurochimici nel cervello animale. Utilizzare la bolla d'aria creata nel tubo sotto il flusso di lavoro per calcolare questo tempo.
   2. Raccolta di campioni durante la registrazione EEG e la stimolazione del potassio
      1. Verificare l'assenza di convulsioni nelle 3 ore precedenti l'inizio della raccolta del campione (registrazioni video-EEG) e continuare a monitorare l'attività convulsiva durante la microdialisi.
      2. Arrestare la pompa che trasporta le siringhe cannulate con tubo FEP riempite con la soluzione di Ringer. Montare sulla pompa un altro set di siringhe da 2,5 mL collegate al tubo FEP con adattatori per tubi riempiti con una soluzione di Ringer modificata contenente 100 mM di soluzione K⁺.
      3. Avviare la pompa a 2 μL/min e lasciarla funzionare. Per un riempimento più rapido del tubo, impostare la pompa a 5 μL/min per il tempo di riempimento. Verificare l'assenza di bolle d'aria nell'impianto. Assicurarsi che il tubo tocchi gli adattatori senza spazi morti in tutti i collegamenti.
      4. Testare la sonda se è pronta per l'uso su un animale come descritto sopra (5.2.1.5).
      5. NOTA: Se per qualche motivo la sonda non funziona, sostituirla. In questi casi, tenere alcune sonde per microdialisi preparate e pronte all'uso vicino alla postazione di lavoro per microdialisi-EEG. Scollegare l'animale dai cavi EEG e anestetizzarlo brevemente con isoflurano, se necessario, per realizzare il cambiamento.
      6. Collegare il tubo FEP delle siringhe riempite con la soluzione di Ringer alla cannula di ingresso della sonda in ciascun animale e attendere la comparsa della goccia di liquido sulla punta dell'uscita.
      7. Collegare l'uscita della sonda al tubo FEP, che porta alla raccolta nella provetta. Inserire il tubo FEP nella provetta chiusa da 0,2 ml con un tappo perforato. Assicurarsi che il tubo rimanga in posizione fissandolo con un pezzo di argilla da modellare.
      8. Continuare a far funzionare la pompa a 2 μl/min per 60 minuti senza raccogliere campioni per equilibrare il sistema (zero campione).
      9. Raccogliere 5 campioni consecutivi di dialisato da 30 minuti (60 μL di volume rispettivo) in condizioni basali (perfusione con la normale soluzione di Ringer). Conservare i campioni sul ghiaccio.
      10. Calcola il tempo impiegato dal liquido per passare dalla pompa alla testa dell'animale (dipende dal volume morto del tubo, cioè dal tempo di bolla d'aria) e cambia il tubo FEP che va dalle siringhe contenenti la normale soluzione di Ringer alle siringhe contenenti la soluzione di Ringer modificata (100 mM K⁺) in questo momento senza fermare la pompa. Verificare l'assenza di bolle d'aria nell'impianto. Lasciare in funzione la pompa per 10 minuti. ATTENZIONE: In 10 minuti di elevata stimolazione del K⁺, gli animali tendono a muoversi freneticamente e di solito presentano un gran numero di scuotimenti bagnati del cane (animali a grappolo di controllo e fuori convulsione) o convulsioni comportamentali (animali epilettici), quindi siate pronti ad intervenire per proteggere i tubi e i cavi dalla torsione.
      11. Dopo 10 minuti, passare il tubo dalle siringhe contenenti 100 mM di soluzione di K⁺ Ringer alla normale soluzione di Ringer e lasciare in funzione la pompa. Non spegnere la pompa durante il cambio della soluzione in modo che ci sia una goccia di liquido all'estremità del tubo da collegare in linea.
      12. Dal momento in cui il dialisato contiene un alto contenuto di potassio, cioè dopo la raccolta del quinto dialisato post-equilibrio, raccogliere le frazioni di dialisato ogni 10 minuti (20 μL) per 1 ora. Raccogliere altri 3 campioni di dialisato da 30 minuti e arrestare la pompa. Conservare i campioni sul ghiaccio.
      13. Conservare i campioni a -80 °C dopo l'esperimento fino all'analisi con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
      14. Ripetere l'esperimento di microdialisi per 3 giorni consecutivi, ad eccezione del gruppo acuto (24 ore) e del primo attacco, in cui si svolge una sola sessione di microdialisi 24 ore dopo l'SE o entro 24 ore dalla prima crisi spontanea (Figura 3).

Figura 1. Preparazione passo dopo passo del dispositivo da impiantare.(A) Elettrodo a 3 canali con elettrodo di messa a terra lungo 10 cm nella sua guaina protettiva a sinistra e cannula guida per microdialisi a destra necessaria per assemblare il dispositivo. (B). L'elettrodo nudo e la cannula guida in dettaglio. Il primo passo consiste nel rimuovere (C) e inserire (D) la cannula guida metallica da e nel suo manichino di plastica alcune volte per facilitarne il rilascio una volta impiantata nella testa dell'animale. Il secondo passo consiste nel piegare due volte l'elettrodo di registrazione attorcigliato da allineare alla cannula guida per dialisi (E, F). (G) La punta dell'elettrodo deve essere tagliata in modo che sia più lunga di 0,5 mm rispetto alla punta della cannula di guida in metallo. (H) Verificare la precisione del taglio utilizzando il calibro digitale. Successivamente, è necessario utilizzare un cerchietto di silicone lungo circa 1 mm per fissare l'allineamento dell'elettrodo al piede della cannula di guida (I). (J) La fotografia che mostra come suonare l'elettrodo e guidare lo stelo della cannula. Il passaggio finale consiste nell'applicare una goccia di resina o colla sul piedistallo della cannula guida, fissandovi il cerchietto in silicone (K). (L) Dispositivo assemblato pronto per essere sterilizzato.

Figura 2. Fotografie di diversi tipi di dispositivi per microdialisi-EEG nei ratti utilizzati (A) e la fotografia del supporto della clip della sonda (B) utilizzato per impiantare questi dispositivi.(A) La cannula guida (in verde) viene sostituita da una cannula per microdialisi in genere 24 ore prima dell'esperimento. Il connettore elettrico del dispositivo (il primo a sinistra è stato utilizzato per le registrazioni descritte in questo manoscritto) consente il collegamento di fili che conducono segnali elettrici all'amplificatore e alle apparecchiature di raccolta dati. Il dispositivo è attaccato chirurgicamente al cranio di ratti anestetizzati e le registrazioni possono essere ottenute in seguito senza causare dolore o disagio nei ratti che si comportano liberamente.

Figura 3. Progettazione sperimentale.La settimana prima dell'induzione dello stato epilettico (SE), ai ratti viene impiantato il dispositivo. L'SE è indotta dalla pilocarpina e gli animali (se non dializzati e uccisi a 24 ore dopo l'SE; i ratti del gruppo acuto) vengono monitorati video per 5 giorni (linea blu), quindi monitorati con video-EEG per valutare la frequenza e la durata delle crisi nelle loro gabbie domestiche (linea verde). Per l'esperimento di microdialisi, i ratti epilettici e i rispettivi ratti di controllo non epilettici vengono trasferiti in un altro impianto EEG dotato di gabbie cilindriche nelle 24 ore precedenti la sessione di microdialisi e ancora monitorati con video-EEG (linea verde chiaro). Le linee rosse verticali rappresentano le sessioni di dialisi in diversi momenti di sviluppo della malattia epilettica. Le linee rosse orizzontali rappresentano i diversi gruppi di animali epilettici (e i rispettivi animali non epilettici), dove la freccia indica l'ultimo giorno della microdialisi e il giorno della morte dell'animale.