Immunomarcatura delle proteine della membrana neuronale in un campione di tessuto cerebrale di topo con frattura da congelamento

Abstract

Fonte: Schönherr, S., et. al. Immunomarcatura combinata optogenetica e replica di frattura da congelamento per esaminare la disposizione specifica dell'input dei recettori del glutammato nell'amigdala di topo. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video dimostra l'immunomarcatura di repliche fratturate da congelamento di tessuto cerebrale di topo per la microscopia elettronica. Le repliche fratturate e rivestite vengono digerite per esporre i recettori. Gli anticorpi primari e secondari marcati con oro vengono aggiunti per marcare specifici recettori della membrana neuronale. La replica è montata su una griglia e visualizzata al microscopio elettronico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione del campione

1. Fissazione cerebrale
   1. Preparazione del fissativo
      1. Per 1 L di fissativo, pesare 10 g di paraformaldeide e aggiungerlo a 300 ml di acqua deionizzata (H₂O). Riscaldare a 55 - 60 ºC per ~10 min mescolando continuamente.
      2. Spegnere il fuoco e aggiungere 7 - 8 gocce di idrossido di sodio 4 N (NaOH). La soluzione dovrebbe diventare limpida in ~10 minuti.
      3. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente o RT, aggiungere 150 ml di una soluzione satura di acido picrico e portare a 500 ml con H₂O deionizzato.
      4. Aggiungere 500 ml di tampone fosfato 0,2 M (PB). Filtrare con carta da filtro. Regolare il pH a 7,4 con NaOH.
      5. Raffreddare il fissativo a 6 ºC e conservarlo in flaconi di vetro scuro per non più di un giorno a 6 ºC.
   2. Perfusione transcardiaca
      1. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di tiopentale (120 mg/kg di peso corporeo). Assicurati che l'animale sia profondamente anestetizzato controllando il riflesso di ritiro del pedale, che dovrebbe essere assente. Posiziona l'animale sul dorso su un tavolo di perfusione con le quattro estremità legate.
      2. Aprire longitudinalmente la parete addominale con le forbici smussate ed eseguire due tagli aggiuntivi lateralmente lungo il bordo caudale della gabbia toracica per esporre il diaframma. Tagliare il diaframma e tagliare la parete toracica al bordo osteocartilagenio su entrambi i lati. Sollevare l'estremità caudale della lastra centrale della parete toracica contenente lo sterno per esporre il cuore.
      3. Rimuovere il pericardio e praticare un piccolo taglio preciso sulla punta del ventricolo sinistro per far entrare la cannula dell'apparato di perfusione. Utilizzare una cannula smussata con un diametro interno di 0,6 mm. Passare delicatamente la cannula attraverso il ventricolo fino a quando la punta appare nell'aorta ascendente e fissare la cannula con una pinza. Per consentire al sangue e al perfusino di uscire dal flusso sanguigno, praticare un taglio nell'atrio destro.
      4. Perfondere i topi per via transcardiaca utilizzando una pompa peristaltica a una velocità di flusso di 5 ml/min inizialmente con soluzione salina tampone fosfato o PBS (25 mM, cloruro di sodio 0,9% o NaCl, pH 7,4) per circa 1 minuto, seguito da fissativo raffreddato con ghiaccio per 7 minuti.
      5. Dopo il fissaggio, recidere la testa del topo con un paio di forbici e poi tagliare la pelle attraverso la linea mediana dal collo al naso. Rimuovere il muscolo per esporre completamente il cranio.
      6. Utilizzando delle forbici affilate, praticare un taglio longitudinale attraverso le ossa occipitali e interparietali partendo dal forame magno. L'uso di una pinzetta sottile rimuove queste ossa per esporre l'intero cervelletto. Quindi fai un altro taglio longitudinale attraverso le ossa parietali e frontali fino all'osso nasale e rimuovili con una pinzetta per esporre l'intero cervello.
      7. Usando una spatola, rimuovere il cervello senza danneggiarlo e metterlo in 0,1 M PB ghiacciato.
2. Sezionamento e rifilatura dei campioni
   1. Taglia un blocco coronale di circa 5 - 6 mm con lame di rasoio contenenti l'area di interesse. Incollarlo sul supporto del vibroslicer con una colla cianoacrilica. Orientare il blocco di tessuto in modo che la neocorteccia sia rivolta verso la lama vibrante. Tagliare le sezioni coronali contenenti l'amigdala a 140 μm con il vibroslicer (Figura 1A) in 0,1 M PB ghiacciato e raccoglierle in una piastra a 6 pozzetti nello stesso tampone.
   2. Sotto uno stereomicroscopio, ritagliare la regione di interesse (qui, l'ammasso paracapsulare medio-dorsale delle masse cellulari intercalate dell'amigdala o ITC; vedi Figura 1B) dalla fetta. Fallo in una capsula di Petri rivestita con elastomero siliconico e riempita con 0,1 M di PB, utilizzando un bisturi oftalmico. Assicurarsi che i blocchi tagliati si inseriscano nel foro del distanziatore (circa 1,5 mm) (Figura 1B).
   3. Spostare i blocchi tagliati in una soluzione di crioprotezione (30% di glicerolo in 0,1 M PB) durante la notte (O/N) a 6 ºC.

2. Congelamento ad alta pressione

NOTA: La Replica di Immunomarcatura per Crinatura da Congelamento (FRIL) consiste in 6 passaggi essenziali (Figura 2): 1) Congelamento rapido ad alta pressione (a 2.300 - 2.600 bar) del campione. 2) Fratturazione del provino. Il piano di frattura generalmente segue il nucleo idrofobico centrale delle membrane congelate, dividendole in due lembi a metà membrana: una metà che si trova adiacente al protoplasma (faccia P) e una metà che si trova adiacente allo spazio extracellulare o esoplasmatico (faccia E). 3) Replicazione del campione mediante deposizione sottovuoto di platino e carbonio. 4) Detergente-digestione del tessuto. 5) Marcatura Immunogold. 6) Analisi della replica mediante microscopio elettronico a trasmissione.

1. Preparazione dei supporti in rame
   NOTA: Per essere maneggiati attraverso le fasi successive della procedura FRIL, i campioni devono essere montati su supporti metallici (oro o rame). Questi vettori variano per dimensioni e design a seconda della modalità di fratturazione e del tipo di macchine utilizzate. Qui, abbiamo utilizzato supporti di rame (Figura 1B, E) e una "tavola a doppia replica" incernierata (vedi Figura 3B), che, una volta aperta, produce una frattura a trazione attraverso il provino congelato (Figura 2). Ciò consente di trattenere e replicare entrambi i lati del campione fratturato.
   1. Polish i supporti in rame con un solvente per l'ossidazione usando un foglio di pelle di camoscio.
   2. Mettere i vettori in una pentola di vetro e pulire due volte con un detergente non ionico (pH ~1,5) in un bagno d'acqua sonicante, quindi lavare abbondantemente in acqua di rubinetto seguita da acqua deionizzata, quindi risciacquare due volte con etanolo.
   3. Sonicare i supporti di rame in acetone per 15 minuti.
   4. Posizionare i supporti su carta da filtro ad asciugare.
   5. Fissare un anello di nastro biadesivo a un supporto di rame (Figura 1C), che fungerà da pozzetto di tenuta per il blocco tagliato (supporto di tenuta).
2. Congelamento del campione
   NOTA: Maneggiare l'azoto liquido con cura e indossando occhiali adeguati.
   1. Accendi l'unità di congelamento ad alta pressione (Figura 1F) per almeno 1,5 ore prima di congelare il campione.
   2. Avviare il riscaldamento premendo il pulsante "RISCALDATORE D'ARIA" e cuocere per 50 min. Impostare la temperatura dell'aria a 80 °C.
   3. Collegare il serbatoio dell'azoto all'unità di congelamento ad alta pressione e premere il pulsante "NITROGEN" per riempire il Dewar interno con azoto liquido. La spia "LIVELLO DI AZOTO" si accende. Avviare il raffreddamento premendo il pulsante "Raffreddamento".
   4. Premere il pulsante "DRIVE IN" quando il "LIVELLO DI AZOTO" si spegne. Verificare che l'impianto idraulico muova il pistone avanti e indietro 3 volte.
   5. Premere il pulsante "AUTO" e il pulsante "NITROGEN". Non appena si accende "READY", l'unità di congelamento ad alta pressione è pronta per il congelamento ad alta pressione.
   6. Posizionare un blocco rifilato nel foro del nastro biadesivo (Figura 1B) utilizzando un anello di filo di platino che è stato fuso in una pipetta di vetro.
   7. Rimuovere l'eccesso della soluzione crioprotettiva utilizzando carta da filtro o un pennello.
      NOTA: Questa procedura è importante anche per rimuovere le bolle d'aria che possono formarsi attorno al tessuto e che potrebbero causare la distorsione della forma e/o dell'ultrastruttura del tessuto.
   8. Sotto uno stereomicroscopio, coprire il supporto con un altro supporto, in modo che il blocco di tessuto sia inserito tra i due supporti.
   9. Inserire il sandwich di supporto nel portacampioni dell'unità di congelamento ad alta pressione (Figura 1D). Inserire il portacampioni nell'unità di congelamento ad alta pressione (ribaltamento verso il basso) e fissarlo avvitando il portacampioni.
   10. Avviare il ciclo di congelamento premendo il pulsante "Jet-Auto". Lavorando il più rapidamente possibile, rimuovere il portacampioni e immergere il puntale con azoto liquido in una scatola isolata. Immergere le punte di due paia di pinze nell'azoto liquido per raffreddarle.
   11. Rimuovere con cautela il panino portante dal portacampioni e metterlo in un crioviale pre-raffreddato. Assicurarsi che i supporti vengano maneggiati solo con pinze raffreddate ad azoto liquido. I crioviali devono essere perforati per consentire all'azoto di fuoriuscire dal flaconcino (Figura 1G).
   12. Ripetere i passaggi da 2.2.6 a 2.2.11 fino a quando tutti i campioni desiderati sono stati congelati. Più panini portanti contenenti lo stesso tipo di campione possono essere conservati nella stessa fiala.
   13. Conservare i crioviali contenenti i vettori in un crioserbatoio fino alla replicazione (Figura 1H).

3. Congelamento-frattura e replicazione

1. Preparazione delle pistole a fascio di elettroni
   1. Prima di inserire le pistole a fascio di elettroni, rimuovi lo scudo con la "piastra deflettore". Posizionare il "calibro di regolazione" per centrare il filamento nel mandrino della pinza attraverso il coperchio del catodo inferiore.
      NOTA: L'estremità di diametro maggiore del calibro di impostazione viene utilizzata per la pistola in carbonio, mentre l'estremità di diametro inferiore è per la pistola in platino.
   2. Far scorrere il nuovo filamento sul manometro fino a quando "le lamine di pressione" possono bloccare le estremità del filamento, assicurandosi che la bobina del filamento non si trovi ad angolo.
   3. Rimuovere il calibro di regolazione e inserire l'asta di carbonio. Fissarlo serrando il mandrino della pinza del supporto dell'asta dell'evaporatore, assicurandosi che l'altezza dell'estremità dell'asta sia al centro della seconda bobina dal basso. Per la pistola di platino, l'altezza dell'estremità dell'asta di platino dovrebbe essere al centro della seconda bobina di filamento dall'alto.
   4. Riposizionare la piastra deflettore e inserire le pistole nell'unità di frattura da congelamento. Pulire le pistole con una sabbiatrice dopo l'uso.
2. Impostazione dell'unità di congelamento-frattura
   1. Accendere l'unità di congelamento della frattura (Figura 3A) portando MAINS su 1. Per una descrizione dettagliata delle procedure di crio-frattura e replicazione, vedere le istruzioni per l'uso fornite dal produttore.
   2. Prima di raffreddare il dispositivo di congelamento-frattura, cuocere l'intero sistema di raffreddamento dell'unità con aria calda. Premere il pulsante "Scongelamento" nell'apparecchio MTC 010 (unità di controllo della temperatura) (Figura 3A) e lasciare che il processo di cottura duri 45 min.
   3. Attivare la stazione a vuoto. L'unità di congelamento-frattura funziona solitamente in un intervallo di vuoto di ~^10-6 - ^10-7 mbar.
   4. Riempire il serbatoio dell'azoto e collegarlo all'unità di rottura del gelo. Verificare che il portavalvola sia asciutto e pulire anche l'ingresso del serbatoio prima di inserire il portavalvola (l'umidità può interferire con il vuoto e l'indicazione di N₂ riempimento del serbatoio).
   5. Iniziare il raffreddamento impostando la temperatura a -115 °C. Il raffreddamento dura circa 45 minuti.
   6. Inserire le pistole a fascio di elettroni e regolare la corrente e la tensione per raggiungere i seguenti parametri di evaporazione:
      Pistola al carbonio: rotazione attivata, posizione 90°, velocità di accumulo del carbonio 0,1 - 0,2 nm/sec
      Pistola al carbonio-platino: rotazione disattivata, posizione 60°, velocità di accumulo 0,06 - 0,1 nm/sec
      NOTA: Se una pistola viene utilizzata per la prima volta dopo la sostituzione dell'asta di carbonio o platino, Degassare per 3 minuti prima dell'uso.

3. Fratturazione e replicazione

   1. Inserisci i panini di trasporto congelati in una doppia tabella di replica assicurandoti che tutte le manipolazioni siano fatte in azoto liquido.
   2. Trasferire la doppia replica del tavolo su un recipiente Dewar e fissarla al ricevitore dello stadio del campione con un angolo di 45°. Il livello di azoto liquido deve essere sempre al di sopra della doppia tabella di replica.
   3. Prelevare la doppia replica del tavolo con il manipolatore del tavolo e inserirla nell'unità di congelamento della frattura sul palco freddo. Attendere circa 20 minuti per consentire alla temperatura del tavolo a doppia replica di regolarsi a -115 °C.
   4. Verificare che il vuoto sia inferiore a ^10-6 mbar e che la temperatura sia di -115 °C.
   5. Frattura del tessuto mediante rotazione manuale in senso antiorario della ruota collegata alla sindone posta sopra il doppio tavolo di replica. Quando la sindone si gira, costringe il tavolo a doppia replica ad aprirsi, fratturando il tessuto.
   6. Premere il pulsante "Alta tensione" nel dispositivo EVM 030 (unità di controllo dell'evaporazione a fascio di elettroni) dell'unità di congelamento-frattura (Figura 3A).
   7. Replicare le superfici esposte del tessuto fratturato (Figura 3C) mediante evaporazione del carbonio (rotante) per mezzo di un cannone a fascio di elettroni posizionato con un angolo di 90° a uno spessore di 5 nm, seguito da un'ombreggiatura unidirezionale con platino-carbonio a un angolo di 60° a uno spessore di 2 nm. Infine, applicare uno strato di carbonio spesso 15 nm da un angolo di 90° (rotante).
   8. Utilizzare i seguenti parametri per l'evaporazione:
      1° carbonio: rotazione attivata, posizione 90°; velocità 0,1 - 0,2 nm/sec; 5 nm
      2° carbonio-platino: posizione 60°; velocità 0,06 - 0,1 nm/sec; 2 nm
      3° carbonio: rotazione attivata, posizione 90°; velocità 0,3 - 0,5 nm/sec; 15 nm
   9. Rimuovere i campioni replicati dall'unità di frattura da congelamento e trasferirli in una piastra ceramica a 12 pozzetti (Figura 4A) riempita con TBS ( Soluzione salina tamponata con tris, pH 7,4).
   10. Utilizzando una vergella ad anello di platino, rimuovere il tessuto replicato dal portacampioni (Figura 4A).
   11. Ripetere i passaggi da 3.3.1 a 3.3.10 fino a quando tutti i campioni non sono stati replicati.

   4. SDS-digestione della replica

   1. Trasferisci la replica in una fiala di vetro da 4 ml riempita con 1 ml di SDS-tampone di digestione (2,5% di sodio lauril solfato, 20% di saccarosio in 15 mM Tris, pH 8,3). Digerire per 18 ore a 80 °C agitando (45 colpi/min).
   2. Trasferire le repliche in una nuova provetta riempita con tampone di digestione SDS e conservarle in RT.

4. Immunomarcatura

NOTA: Tutte le incubazioni vengono eseguite a RT con agitazione delicata, ad eccezione delle incubazioni con anticorpi.

1. Lavare la replica per 10 minuti in un tampone di digestione fresco di sodio dodecil solfato (SDS).
2. Lavare la replica una volta con 2,5% BSA (albumina sierica bovina) in soluzione salina tamponata Tris o TBS per 5 minuti, e poi 3 x 10 minuti con BSA allo 0,1% in TBS.
3. Bloccare i siti di legame non specifici in TBS con il 5% di BSA per 1 ora.
4. Applicare anticorpi primari diluiti in BSA-TBS al 2%. Eseguire le incubazioni in una goccia da 30 μl (Figura 4B) in una camera umida a 15 °C per 72 ore (Figura 4C).
   1. Per questo studio, elabora entrambe le repliche dal tessuto fratturato. Incubare una replica con un anticorpo policlonale di cavia sollevato contro gli amminoacidi 717 - 754 del GluR1 di topo comune a tutti i subrecettori dell'acido α-Ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolopropionico o AMPA-R (diluizione: 1:200) o un anticorpo monoclonale di topo sollevato contro una proteina di fusione ricombinante che ricopre gli amminoacidi 660 - 811 della subunità NR1 del recettore N-metil-D-aspartato o NMDA-R (diluizione: 1:500) e un anticorpo policlonale di coniglio sollevato contro la proteina fluorescente verde (diluizione: 1:300).
   2. Incubare l'altra replica con un anticorpo policlonale di coniglio sollevato contro un peptide sintetico corrispondente agli amminoacidi 384 - 398 del recettore μ-oppioide di ratto (diluizione: 1:500).
5. Lavare in TBS con 0,05% BSA (3 x 5 min.).
6. Applicare anticorpi secondari. Per questo studio, utilizzare anticorpi coniugati gold (5 nm per i recettori ionotropici del glutammato, 10 per i recettori μ-oppioidi e/o 15 nm per la proteina fluorescente gialla Channelrhodopsin-2 o ChR2-YFP) diluiti in TBS con il 2% di BSA. Diluire gli anticorpi secondari 1:30 e incubare in una goccia di 30 μl a 15 °C O/N.
7. Lavare 3 x 5 min in 0,05% BSA-TBS a RT.
8. Lavare 2 x 5 min in acqua ultrapura.
9. Montare la replica su una griglia a barre parallele a 100 linee rivestita in formvar (Figura 4D).

Risultati

Figura 1. Preparazione dei tessuti e congelamento ad alta pressione. (A) Il vibroslicer viene utilizzato per sezionare il tessuto. (B) Una sezione coronale del cervello di topo contenente l'amigdala è mostr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Preparazione
Paraformaldehyde EM grade	Agar Scientific Ltd., Regno Unito	AGR1018
Soluzione di acido picrico saturo	Sigma-Aldrich, USA	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, Germany	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, Germany	1063451000
NaCl	Merck Millipore, Germania	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, Germania	T198.1
Thiopental	Sandoz, Austria	5,133
Glicerolo	Sigma-Aldrich, USA	G5516-500ML
Sistema di acqua ultrapura GenPure	Thermo Fisher Scientific, USA	50131235
Pompa peristaltica	ISMATEC, Germania	ISM 930C
Carta da filtro	MACHEREY-NAGEL, Germania	MN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000S	Leica Microsystems, Austria
Bisturi oftalmico	Alcon Laboratories, USA
Cannula di perfusione	Vieweg, Germania	F560088-1
Congelamento
Supporti in rame	Ufficio di ingegneria M. Wohlwend, CH	528
Sidol Polish	Henkel, Germania
Pelle di camoscio	Negozio di articoli per la casa
Perforatore, 1,5mm	Stubai, Austria
Denaturato ethanol	Donauchem, Austria
Acetone	Roth, Germania	9372.5
Macchina per il congelamento ad alta pressione HPM 010	BalTec, CH; ora Leica Microsystems	HPM010
Stereo-microscopio	Olympus, Japan	SZX10
Azoto liquido
Cryo-fials	Roth, Germany	E309.1
CryoCane	Nalge Nunc International,USA	5015-0001
CryoSleeve	Nalge Nunc International,USA	5016-0001
Recipiente per lo stoccaggio di azoto liquido	Cryopal, Francia	GT38
Detergente non ionico (Lavocid)	Werner & Mertz Professional, Germania
Frattura da congelamento e replicazione
Sandblaster, Mikromat 200-1	SCHERZO Joisten & Kettenbaum, Germania	SANDURET 2- K
Siliciumcarburo SIC 360, granulometria 25 - 21μ	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germania	955932
Sistema di frattura da congelamento BAF 060	BalTec, CH; ora Leica Microsystems<
Ceramic 12 well plate	Gröpel, Austria	14511
Trizma base	SIGMA, USA	T1503
Trizma hydrochloride	SIGMA, USA	T3253
Cloruro di sodio	Merck, Germania	1,06,40,41,000
SDS, Sodio lauril solfato	Roth, Germania	5136.1
Sucrose<	1,07,68,71,000
TRIS	Roth, Germania	5429.3
Forno di ibridazione universale	Binder, Germania<
Immunolabelling
BSA	SIGMA, USA	A9647
Anticorpo anti-GFP	Molecular Probes, USA	A11122
Anticorpo anti-pan-AMPAR	Frontier Institute, Japan	pan AMPAR-GP-Af580-1
Anticorpo anti-NMDAR1, clone 54.1	Merck Millipore, Germania	MAB363
Anticorpo Recettore Oppioide-Mu (MOR)	ImmunoStar, USA	24216
EM capra anti-cavia, 5nm; anticorpo secondario	BBInternational,	EM. GAG5
EM capra anti-coniglio, 15nm; anticorpo secondario	BBInternational,	EM. GAR15
Anti-coniglio asino, 10nm, anticorpo secondario	AURION, Paesi Bassi	DAR 10nm
Griglie di rame, 100 Parallel Bar	Agar scientific, UK	G2012C
Incubator<	MO-RC
Pioloform Powder	Agar scientific, UK	R1275
Cloroformio	Roth, Germania	3313.1

dei tessuti ad alta pressionetd style='width:153pt;'>BAF060td style='width:164pt;'>Merck, Germanytd style='larghezza:153pt;'>7001-0050td style='width:164pt;'>Major Scienza, USA