Registrazione simultanea di pletismografia ed elettromiografia in un modello murino di SLA

Abstract

Fonte: Jensen, V. N., et al. Misurazione ripetuta dell'attività dei muscoli respiratori e della ventilazione in modelli murini di malattia neuromuscolare. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video mostra il metodo per registrare simultaneamente i segnali di pletismografia ed elettromiografia in un modello murino di SLA in movimento libero. La procedura prevede l'utilizzo di elettrodi impiantati e di un trasmettitore per catturare l'attività muscolare, insieme a una camera di pletismografia per monitorare i modelli di respirazione, per studiare il ruolo dei muscoli accessori nel topo SLA.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Preparare il topo per l'intervento chirurgico

1. Scegli il topo desiderato per l'impianto (ad esempio, SOD1(G93A) o controllo) e pesa l'animale.
   NOTA: L'età e il peso raccomandati per un topo (maschio o femmina) sottoposto a questo intervento chirurgico sono rispettivamente P56 - P120 e ≥ 24 g.
2. Anestetizza il mouse sotto il 3,5% di isoflurano con una portata di ossigeno di 2 L/min. Eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi e un pizzico della coda per assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato.
3. Una volta anestetizzato, rimuovi il mouse dalla drop box e mantieni l'anestesia tramite un cono nasale impostando il livello di isoflurano a 1,5% e la portata di ossigeno a 1 L/min. Esegui un pizzicamento del dito del piede e/o della coda per assicurarti che l'anestesia venga mantenuta.
4. Applica un unguento oftalmico lubrificante per evitare che gli occhi si secchino durante l'intervento chirurgico.
5. Radi il mouse per esporre un sito chirurgico tra l'orecchio e la spalla (Figura 1C).
6. Taglia le unghie dei piedi omolateralmente al sito chirurgico per ridurre la possibilità che il topo estragga i cavi o causi ferite graffiando durante il processo di guarigione.
7. Tampona alternativamente il sito chirurgico, prima con disinfettante e poi con isopropanolo. Ripeti altre 2 volte.

2. Impiantare il dispositivo di telemetria per registrare l'attività dell'elettromiografia (EMG) di scaleni e trapezi<

1. span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>Posiziona l'animale sotto un microscopio da dissezione, su un lato sopra un tampone sterile che copre un termoforo, e fissa il cono nasale in posizione con del nastro adesivo. Si noti che è meglio impiantare il lato destro per ridurre il segnale dell'elettrocardiogramma (ECG) proveniente dal cuore.
   NOTA: Monitora la respirazione e regola i livelli di isoflurano, se necessario, per mantenere una frequenza respiratoria regolare e un piano chirurgico di anestesia appropriato.
2. Tira l'arto anteriore verso il piede omolaterale lungo il busto.
   NOTA: Questa posizione sposta la scapola caudalmente, fornendo un accesso chirurgico ai muscoli scaleno e trapezio.
   1. Prendi la pinza curva smussata, trattieni la zampa anteriore omolaterale al sito chirurgico e fissa la zampa con del nastro adesivo (Figura 1C). Utilizzare un nastro chirurgico adesivo resistente per assicurarsi che la zampa sia sicura per tutta la durata della procedura.
3. Indossa un nuovo paio di guanti chirurgici. Utilizzare il bisturi per praticare un'incisione obliqua, lunga circa 2 cm, tra la spalla e l'orecchio (linea rossa nella Figura 1C).
4. Usando due pinze per laminectomia #2, una per mano, tira indietro il cuscinetto adiposo e allarga i muscoli trapezio e platisma per esporre la fascia che copre i muscoli sternocleidomastoideo e scaleno (Figura 1D ed E).
5. Usa il muscolo sternocleidomastoideo pallido e il nervo frenico come punti di riferimento per identificare i muscoli scaleni. Si noti che il nervo frenico corre parallelo ai muscoli scaleni, mentre lo sternocleidomastoideo si trova in posizione inferiore. I muscoli scaleni corrono obliquamente dalle vertebre cervicali alle costole sotto il muscolo trapezio. Gli elettrocateteri biopotenziali saranno inseriti nel muscolo scaleno anteriore, che può essere identificato come il muscolo che corre adiacente al nervo frenico (Figura 1F e G).
   NOTA: Attenzione. Quest'area è altamente vascolarizzata e bisogna fare attenzione per evitare di tagliare l'arteria succlavia. Evitare di danneggiare il nervo frenico e il plesso brachiale.
6. Una volta identificati i muscoli scaleno e trapezio (Figura 1G), crea una tasca sottocutanea per il trasmettitore sul dorso dell'animale, tra le scapole.
   1. Usa le forbici per separare i tessuti. Inserire le punte smussate appena sotto la pelle e allargarle fino a formare un'apertura della tasca di circa 1,25 volte la larghezza del trasmettitore (Figura 1H).
      NOTA: Il trasmettitore dovrebbe essere inserito con una resistenza minima, ma la tasca non dovrebbe essere così grande da permettere al trasmettitore di muoversi da solo. Se la tasca è troppo piccola, il trasmettitore potrebbe sfregare contro la pelle, causando irritazione che potrebbe indurre l'animale a graffiare la pelle e/o estrarre il guinzaglio. Se la tasca è troppo grande, potrebbero formarsi sieromi o il trasmettitore potrebbe migrare in una posizione sfavorevole.
7. Risciacqua con soluzione salina calda e sterile e inserisci il trasmettitore con il lato più piatto contro il muscolo. Posizionare il trasmettitore in modo che sia piatto e che i fili emergano dalla tasca, paralleli tra loro anziché attorcigliati (Figura 1I). Arricciare la lunghezza di filo in eccesso sotto il dispositivo e stenderlo in piano.
8. Fai scorrere i cavi dal trasmettitore ai muscoli scaleno e trapezio in modo che i due set di cavi bipotenziali siano piatti e paralleli l'uno all'altro.
9. Usa la pinza per laminectomia per separare lo scaleno anteriore dai muscoli circostanti e inserisci un ago calibro 25 perpendicolare alle fibre muscolari attraverso il muscolo scaleno.
   1. Inserisci un elettrocatetere nella punta dell'ago e poi estrai l'ago dal muscolo, lasciando dietro di te l'elettrocatetere inserito nel muscolo fino all'isolamento del filo (Figura 1J e K). Registra quali mine colorate sono inserite in quale muscolo.
10. Posiziona una piccola goccia di adesivo cianoacrilato sull'estremità esposta del filo, vicino al muscolo dove è inserito l'elettrocatetere, e fai scorrere rapidamente il cappuccio del piombo sul filo in modo che nessun filo sia esposto tra il cappuccio del piombo e il muscolo (Figura 2A e B).
    NOTA: Sebbene sia una pratica accettata fissare gli elettrocateteri EMG con cianoacrilato, un metodo alternativo consiste nel legare un nodo di sutura di seta attorno al cappuccio di piombo.
11. Taglia il filo in eccesso distalmente al cappuccio e applica una goccia di adesivo cianoacrilato all'estremità del cappuccio/filo di piombo. Dare alla colla il tempo di polimerizzare prima di rilasciarla (Figura 2C e D).
12. Segui gli stessi passaggi (passaggi 3.10-3.12) per inserire l'elettrocatetere di polarità opposta parallelo al primo nello stesso muscolo, a 1 - 2 mm di distanza dal primo.
13. Ripeti i passaggi 3.10 - 3.12 per inserire gli elettrocateteri nel muscolo trapezio, che si trova appena anteriormente al muscolo scaleno (Figure 1L e M).
14. Assicurati che i cavi siano fissati in posizione e che ci sia abbastanza gioco per consentire all'animale di eseguire movimenti del corpo senza tirarli. Assicurarsi che la lunghezza eccessiva del guinzaglio non spinga contro la pelle, poiché ciò potrebbe causare irritazione che potrebbe indurre l'animale a graffiare o estrarre il guinzaglio. Riposizionare i cavi, se necessario, per evitare qualsiasi potenziale disagio.
15. Rimuovi delicatamente il nastro che tiene premuto l'arto anteriore. Tira indietro il cuscinetto adiposo sopra il muscolo e usalo per coprire gli elettrocateteri inseriti. Chiudere l'incisione con adesivo cianoacrilato riunendo i lembi di pelle in modo che l'incisione si allinei. Pizzica una parte dei lembi di pelle insieme alla pinza curva e applica una piccola linea di adesivo cianoacrilato lungo questa linea.
16. Inietta 0.1 mL di carprofene per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio mentre l'animale è ancora sotto anestesia.
    NOTA: Continua a somministrare 0,1 ml di carprofene una volta al giorno per 1 - 2 giorni dopo l'intervento, e poi secondo necessità dopo.
17. Rimuovi l'animale dall'ogiva e mettilo in una gabbia pulita nell'incubatrice preriscaldata fino a quando non si sveglia e si muove volontariamente intorno alla gabbia. Successivamente, tieni l'animale nell'incubatrice per almeno 15 minuti, monitorandone i movimenti e la vigilanza.

3. Postoperative Care

1. House animali separatamente dopo l'intervento chirurgico. Fornisci agli animali in via di guarigione gel dietetico e una bottiglia d'acqua.
2. Monitora l'animale per i primi 30 minuti dopo l'intervento. Controllare l'animale almeno ogni ora per 5 ore dopo l'intervento. Nei giorni successivi all'intervento, controllare almeno due volte al giorno.
3. Fai attenzione alla necrosi, all'infezione lungo l'incisione e all'interno della cavità corporea contenente l'impianto (ad esempio, calore, gonfiore e arrossamento) e alla formazione di sieroma.
   NOTA: Questi segni si verificano entro la prima settimana dopo l'intervento. La figura 1N mostra un animale sano e guarito un mese dopo l'intervento. Sebbene le registrazioni EMG possano essere effettuate immediatamente dopo l'impianto, agli animali viene concessa almeno una settimana per guarire prima di registrare l'EMG e la pletismografia, poiché i segnali ECG possono essere elevati subito dopo l'impianto.

4. Acquisizione simultanea di segnali

1. di elettromiografia e pletismografiaAttiva tutte le apparecchiature di acquisizione, incluso il flusso di polarizzazione.
   NOTA: La portata per i topi è tipicamente impostata a 1.0 L/min.
2. Calibra la/e camera/e di pletismografia utilizzando un flussometro.
   NOTA: Controlla periodicamente le camere di pletismografia per assicurarti che le guarnizioni non siano incrinate o rotte. Per mantenerne il buono stato, rivestire le guarnizioni in gomma con un lubrificante come il grasso sottovuoto una volta alla settimana.
3. Calibrazione del trasmettitore di input come specificato dal produttore.
4. Posiziona il mouse nella camera di pletismografia per almeno 1 ora per acclimatarla prima di registrare EMG e pletismografia. Utilizzando più camere, è possibile registrare da un mouse mentre il mouse successivo si sta acclimatando in una seconda camera. Non accendere il trasmettitore durante il periodo di acclimatazione per risparmiare la carica della batteria (Figura 1O).
5. Prima della registrazione (ma dopo la calibrazione), accendi il trasmettitore posizionando un forte magnete entro 1 pollice dall'animale impiantato; una luce rossa sulla parte anteriore del ricevitore indicherà quando il trasmettitore è acceso.
6. Inizia l'acquisizione utilizzando il menu a tendina etichettato "Acquisizione" e scegli "Inizia acquisizione." Sebbene la durata della registrazione possa variare in base all'esperimento, una tipica pletismografia e registrazione EMG dura da 1 a 3 ore.
   NOTA: Il trasmettitore ha una frequenza di campionamento intrinseca di 240 Hz. Nel software viene impostata una frequenza più veloce di 500 Hz per interpolare tra i punti e fornire una forma d'onda più fluida. Il filtro passa-basso (che funge da filtro anti-alias) e il filtro passa-alto nell'impianto specificano la larghezza di banda da 1 a 50 Hz per questo dispositivo di telemetria. L'interferenza A/C a 60 Hz non contribuisce all'eccesso di rumore nel segnale EMG perché gli impianti sono alimentati a batteria e l'animale protegge l'impianto e i cavi dai campi elettrici. La pletismografia, l'EMG e il video vengono sincronizzati automaticamente in tempo reale tramite software di acquisizione.
7. Quando l'acquisizione è terminata, spegni il trasmettitore con un magnete e rimuovi l'animale dalla camera.

Risultati

Figura 1. Impianto di un dispositivo di telemetria per misurare l'EMG dei muscoli respiratori. (A) Trasmettitori di telemetria con due coppie di derivazioni di biopotenziale per misurare l'EMG. I ...

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