Questo protocollo descrive l'infusione controllata di sangue autologo nella regione pontina del cervello di un ratto per modellare una massiccia emorragia pontina. Lo scopo è quello di simulare un'emorragia cerebrale localizzata aumentando la pressione localizzata.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Induzione di una massiccia emorragia pontina in un modello di ratto mediante iniezione di sangue autologo
1.1K visualizzazioni
⸱
28 aprile 2025
In questo articolo
Abstract
Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
- Animali e strumenti
- Usa ratti Sprague-Dawley maschi di 8 settimane che pesano 250 ± 10 g.
- House i ratti per almeno 7 giorni prima dell'intervento chirurgico in condizioni ambientali controllate con una temperatura ambiente di 25 °C, umidità relativa del 65% e un ciclo luce-buio di 12/12 ore.
- Fornisci cibo e acqua senza limiti.
- Prepara gli strumenti (Figura 1A-E).
2. Inietta il sangue nel pons
- Pesa di nuovo i ratti 3 giorni prima dell'intervento chirurgico per selezionare ratti con peso corporeo adatto per gli esperimenti.
- Durante i 3 giorni prima della modellazione, addestra i ratti a camminare sulla trave di equilibrio 3 volte al giorno per garantire che i ratti normali possano passare la trave di equilibrio senza pause.
- Preriscalda il termoforo a 37 °C prima dell'anestesia.
- Attacca un microtrapano al supporto sul telaio stereotassico.
- Inietta ai ratti 50 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xilazina per via intraperitoneale. Attendi fino a quando non c'è una risposta di pizzicamento delle dita.
- Trasporta il ratto nel fotogramma stereotassico in posizione prona. Metti le barre auricolari sopra il condotto uditivo per fissare la testa. Fissare il cranio in posizione orizzontale per evitare l'inclinazione dell'iniezione (Figura 1F).
- Mantenere l'anestesia con isoflurano (97,5% di ossigeno e 2,5% di isoflurano) attraverso un cono di naso stereotassico con una porta di ingresso e uscita.
- Usa un unguento per gli occhi per mantenere umida la cornea.
- Radere i capelli sopra il cranio con un micro rasoio.
- Disegna una linea mediana di 3 cm con un pennarello nel cranio dalla linea del canto laterale bilaterale a 0,5 cm dietro la fontanella posteriore, come mostrato nella Figura 1F.
- Applica lo scrub chirurgico Entoiodio in modo circolare, iniziando dal centro della linea mediana segnata e ruotando verso l'esterno.
- Posiziona il telo chirurgico.
- Fai un'incisione con un bisturi lungo la linea mediana segnata.
- Usa un batuffolo di cotone per rimuovere qualsiasi potenziale sangue.
- Posiziona un pezzo di pinza su ciascun lato del lembo del cuoio capelluto per esporre il cranio (Figura 1G).
- Immergi un batuffolo di cotone in soluzione salina allo 0,9% e rimuovi delicatamente i tessuti connettivi dall'osso del cranio per evitare che i tessuti connettivi rimangano impigliati nel microtrapano.
- Segna il punto centrale del bregma come punto di origine tramite un pennarello.
- Esegui una craniotomia (1 mm di diametro) utilizzando un microtrapano a AP-9.0 mm, Lat 0 mm (Figura 2B e Tabella 1). Procedere con cautela perché questo punto è molto vicino al seno venoso (Figura 1G).
- Rimuovi il microtrapano dalla cornice stereotassica.
- Metti una siringa Hamilton da 100 μL nel supporto stereotassico (Figura 1K). Accendere l'interruttore della pompa di iniezione, fare clic sul pulsante di inalazione rapida, aspirare la soluzione di eparina (12500 U diluita in 100 ml di soluzione fisiologica) a 100 μL e quindi scolarla completamente per evitare la coagulazione del sangue troppo velocemente.
- Applica lo scrub chirurgico alla clorexidina e alcol al 75% su tutta la coda dalla radice alla punta almeno 3 volte per disinfettare la pelle, ammorbidire l'eccitazione e dilatare la vena della coda per aumentare il tasso di successo dell'iniezione.
- Attacca un'agopuntura del cuoio capelluto a una siringa da 1 ml.
- Inserisci l'agopuntura del cuoio capelluto in una vena laterale della coda a 3 cm dalla punta della coda e preleva 150 μL di sangue (Figura 1H).
- Rimuovi l'agopuntura del cuoio capelluto dalla siringa da 1 ml.
- Trasferisci il sangue in una provetta (Figura 1I).
NOTA: Trasferisci rapidamente per prevenire la coagulazione del sangue. - Cambia i guanti chirurgici.
- Scegli la modalità di prelievo, imposta il volume a 100 μL, imposta la velocità a 200 μL/min, fai clic sul pulsante RUN e aspira 100 μL di sangue nella siringa Hamilton (Figura 1J).
- Scegli la modalità Infuse e imposta la velocità a 1 μL/min.
- Avanza la siringa fino a quando la punta raggiunge 9,2 mm sotto la superficie del cervello (Figura 2C e Figura 1L).
- Fai clic sul pulsante Esegui per iniettare i primi 10 μL di sangue a una velocità di 1 μL/min (Tabella 1).
- Ferma l'iniezione e lascia la siringa in posizione per 20 minuti per evitare che il sangue fluisca nello spazio subaracnoideo.
- Ritrai la siringa fino a quando la punta arriva a 9,0 mm sotto la superficie del cervello.
- Riavvia l'iniezione alla stessa velocità di 1 μL/min fino a quando il sangue residuo non è stato iniettato completamente.
- Lascia la siringa in posizione per 10 minuti per evitare il riflusso del sangue.
- Rimuovi lentamente la siringa dal cervello.
- Usa del cemento osseo per coprire il foro della craniotomia.
- Quando il cemento si asciuga, sutura la ferita con un filamento di sutura in poliammide 4-0. Dopo aver cucito 3 o 4 punti, fare 2-1-1 nodi chirurgici standard.
- Per prevenire l'infezione, iniettare nel ratto penicillina (0,25 mL, 80 UI diluita in 4 mL di soluzione fisiologica) per via intraperitoneale.
- Inietta i ratti per via sottocutanea con Butorphanol tartrato (2,5 mg/kg) e ripeti l'iniezione ogni 2 ore per alleviare il dolore postoperatorio fino a 24 ore dopo l'intervento.
- Osserva il ratto ogni 15 minuti fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia. Rimettilo nella gabbia originale, con un termoforo sotto la gabbia. Fornisci al topo libero accesso a cibo e acqua fino al sacrificio.
Table 1: Iniezione di sangue autologo.
1 μL/min
20 min
20 min
AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9.2 mm
1 μL/min
10 min
Mild | Moderate | Enorme | |
Volume totale | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
Prima iniezione | |||
Stereotactic coordinates | AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9.2 mm | ||
Volume | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
Velocità | 1 μL/min< | 1 μL/min | |
Interval time< | 20 min< | ||
Seconda iniezione | |||
Stereotactic coordinates | AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9.0 mm | ||
Volume | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
Velocità | 1 μL/min< | 1 μL/min | |
Prima del ritiro dell'ago | 10 min | 10 min | |
AP: posizione anteroposteriore | |||
Lat: laterale | |||
vert: vertical | |||
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Figura 1: Strumenti e procedura della chirurgia. (A) Macchina per anestesia. (B) Strumenti chirurgici. (C) Microtrapano. (D) Pompa di microiniezione. (E) Apparato stereotassico. (F) Una linea è segnata al centro del cranio. (G) La freccia gialla indica la posizione del trapano. (H) Drenaggio del sangue dalla vena caudale. (I) Trasf...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| 100ml Soluzione salina | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparazione del diluente |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Iniezione di sangue | |
| Siringa da 1ml | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Prelievo del sangue autologo dalla vena |
| 75% di alcoltd | Disinfezione della coda | ||
| Nastro adesivo | Shanghai Jinzhong | Strumenti chirurgici | |
| Sistema di anestesia animale | RWD | R510-31S-6 | Induzione e mantenimento dell'anestesia |
|---|---|---|---|
| Trave di equilibrio< | Per i punteggi di deficit neurologico | ||
| Cemento osseo | Shanghai Xinshiji< | Strumenti chirurgici | |
| Butorphanol tartrato | Jiangsu Hengrui | Per la gestione del dolore | |
| Trapano cranico elettrico | Biotecnologia Nanjing Darwin< | Realizzazione di un foro di bava sul cranio | |
| EP tube | Nantong Surui< | Trasferimento di sangue | |
| Crema occhi eritromicina | Farmacia dello Yunnan | < | |
| Pad riscaldante | giungla pericolosatd | Tenersi al caldo | |
| Iniezione di eparina sodica | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparazione del diluente |
| IndoPhors | Guoyao della Cina | < | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Indurre e mantenere l'anestesia |
| Micro-pompa di iniezione | Baoding Leifu< | ||
| Porta ago | Shanghai Jinzhong< | Strumenti chirurgici | |
| Penicilina | Guoyao of China | Prevenzione | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp needle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Prelievo del sangue autologo dalla vena |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | |
| forbici da taglio | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Apparato stereotassico | RWD | 900-00001-00 | Per il |
| Asciugamano chirurgico | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Strumenti chirurgici |
| Ago di sutura | Shanghai Jinzhong | Strumenti chirurgici | |
| forbici da sutura | Shanghai Jinzhong | J25041 | |
| Pinza di tenuta del tessuto | Shanghai Jinzhong | J31080 | Strumenti chirurgici |
