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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Assemblaggio degli occhiali per topi
- Preparare le parti necessarie per l'assemblaggio degli occhiali (Figura 1a). Per ogni mouse, preparare tutto quanto segue: un bastoncino di nylon montato sulla testa, un telaio in titanio superiore e uno inferiore, due lenti con poteri adeguati in base allo scopo dell'esperimento, una vite di dimensioni M1.4 con una lunghezza di 10 mm, un dado per vite di dimensioni M1.4, una rondella piana per vite di dimensioni M1.4 con uno spessore di 0,3 mm, NOTA: Esistono due tipi di cornici con altezze diverse. Per un mouse, vengono utilizzati un fotogramma superiore e un fotogramma inferiore come set. Le montature più alte dovrebbero essere posizionate sopra quelle inferiori per rendere simmetrici i campi visivi. Le montature e le lenti sono appositamente progettate e prodotte dal gruppo di ricerca degli autori. Questi sono disponibili contattando gli autori corrispondenti di questo articolo. Altre parti possono essere trovate nei negozi di utensili al dettaglio.
- Assemblare separatamente la montatura per l'occhio destro e sinistro.
- Disporre la punta dell'unghia in modo che sia rivolta verso l'esterno per ottenere il miglior effetto protettivo. Regolare l'angolo tra la punta dell'unghia e l'inquadratura in modo che sia di circa 130° per evitare di mascherare il campo visivo del mouse (Figura 1b). Far aderire le punte delle unghie artificiali alla montatura utilizzando l'adesivo cianoacrilato.
NOTA: Le punte delle unghie possono aiutare a proteggere la lente dai graffi del mouse. La direzione delle punte delle unghie deve essere opposta perché la montatura superiore e la montatura inferiore vengono utilizzate rispettivamente per l'occhio destro e l'occhio sinistro. - Attendere almeno 12 ore per far asciugare completamente l'adesivo, quindi utilizzare un tagliaunghie per regolare la forma delle punte delle unghie in modo che sia di circa 1 cm × 1 cm tagliando e rifilando.
- Far aderire la lente alla montatura utilizzando l'adesivo cianoacrilato. Posizionare l'obiettivo sulla montatura a mano e tenere la montatura orizzontalmente. Iniettare l'adesivo cianoacrilato dal bordo della lente e lasciare che l'adesivo si diffonda per tensione superficiale.
NOTA: L'adesivo eroderà la lente e influenzerà la sua trasparenza, quindi assicurati che l'adesivo tocchi solo la parte periferica della lente. Utilizzare la lente planometrica a 0 diottrie (D) come controllo e la lente negativa per indurre la miopia. L'effetto delle diverse potenze delle lenti negative (da –10 D a –50 D) è stato descritto altrove4. Per massimizzare l'induzione della miopia, si consiglia una lente -30 D per indurre la miopia. La FDM può anche essere indotta con lo stesso dispositivo semplicemente cambiando la lente nel tappo del microtubo da 1,5 mL come diffusore.
- Serrare la vite nel bastoncino di nylon insieme alla rondella dal lato piatto del bastoncino. Preparare rispettivamente gli occhiali e i bastoncini prima dell'esperimento e conservarli per un ulteriore utilizzo (Figura 1c).
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Fissaggio del telaio sul cranio del topo.
- Applicare una goccia di collirio allo ialuronato di sodio purificato allo 0,1% per prevenire la secchezza su ciascun occhio.
NOTA: I colliri sulla superficie dell'occhio influenzeranno i valori di rifrazione e le misure di lunghezza assiale. Non utilizzare il collirio dopo l'anestesia fino a quando non sono state effettuate tutte le misurazioni. - Metti il mento del topo anestetizzato su un pendio di argilla o qualsiasi cosa che possa essere usata come cuscino per rendere orizzontale il piano anteriore del cranio.
- Sterilizzare i capelli e il cuoio capelluto tra le orecchie e gli occhi utilizzando un batuffolo di cotone con etanolo al 70%.
- Taglia la pelle tra le orecchie e gli occhi per esporre il cranio per circa 0,8 sq.cm usando forbici e pinzette chirurgiche. Utilizzare un liquido mordenzante dentale e un batuffolo di cotone per rimuovere il periostio. Sterilizzare le forbici chirurgiche e le pinzette con etanolo al 70% prima dell'intervento chirurgico di ciascun topo.
NOTA: Potrebbe essere necessario tagliare i capelli e indossare guanti sterili. Prima di questa procedura, verificare le disposizioni del comitato competente per la cura degli animali. Nella maggior parte dei casi, il liquido per mordenzatura dentale è uno degli accessori del sistema adesivo dentale autopolimerizzante. Se il liquido per mordenzatura dentale non è disponibile, utilizzare invece il 70% di etanolo. - Assembla una serie di montature senza lente per fissare il bastoncino nella giusta posizione. Metti le cornici sulla testa del mouse. Regolare attentamente la posizione delle montature per assicurarsi che entrambi gli occhi siano al centro dell'inquadratura vuota.
- Utilizzare un sistema adesivo dentale autopolimerizzante per fissare il bastoncino sulla testa del mouse. Fare attenzione a non far fluire il liquido del sistema di adesione nell'occhio del mouse.
NOTA: Il metodo per utilizzare il sistema adesivo dentale autopolimerizzante è diverso tra i prodotti. Fare riferimento alle istruzioni con attenzione.
ATTENZIONE: Alcuni dei reagenti nel sistema adesivo dentale possono essere tossici. - Attendere circa 5 minuti e rimuovere il telaio e il dado con cautela senza cambiare la posizione del bastoncino (Figura 2a).
- Iniettare 0,75 mg/kg di atipamezolo cloridrato per via intraperitoneale per aiutare il topo a riprendersi dall'anestesia più rapidamente. Metti il mouse in una gabbia individuale fino a quando non si è completamente ripreso. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. Inizio dell'induzione della miopia e del mantenimento successivo
- Attendere almeno 24 ore dopo l'intervento chirurgico per consentire al topo di riprendersi completamente dall'anestesia. Afferra il bastoncino e indossa le montature con le lenti. L'incentivo inizia in questo momento (Figura 2b).
NOTA: Per ridurre al minimo il disagio durante il recupero dall'anestesia e dare abbastanza tempo al sistema adesivo dentale di coagulare, si consiglia vivamente di indossare il telaio dopo che i topi si sono completamente ripresi dall'anestesia. Il cemento resinoso del sistema adesivo coprirà completamente il taglio del cuoio capelluto. Pertanto, non è necessario alcun trattamento post-chirurgico specifico per prevenire l'infezione e migliorare il dolore post-chirurgico. Subito dopo aver indossato la montatura per la prima volta, i topi saranno troppo consapevoli dell'esistenza della lente e la graffieranno molto. Il comportamento grossolano tornerà alla normalità dopo alcune ore. I topi con lenti possono essere mantenuti con la stessa densità dei topi normali. - Rimuovi la montatura e pulisci le lenti e le punte delle unghie con batuffoli di cotone almeno due volte a settimana per mantenere la trasparenza della lente.
NOTA: Non è necessario mettere il mouse sotto anestesia per rimuovere e mettere la cornice. Fornire supporto ai topi su cui sedersi, piuttosto che farli appendere mentre si lavora con loro, potrebbe ridurre l'angoscia. - Se è necessaria una misurazione intermedia, mettere il topo sotto anestesia e misurare il topo come descritto in precedenza. L'induzione può essere continuata dopo che il topo si è ripreso dall'anestesia.
- Pulisci la gabbia almeno due volte a settimana.
NOTA: Questo aiuta a mantenere la nitidezza dell'obiettivo. Può essere utile anche mettere una rete tra il topo e il fondo della gabbia per filtrare gli avanzi di cibo. - Monitora il peso corporeo e il comportamento grossolano. Confrontali con topi della stessa età non toccati durante l'intero processo sperimentale.
NOTA: Fatta eccezione per alcuni comportamenti di graffio, non si riscontrano cambiamenti significativi, incluso il peso corporeo, tra topi sperimentali e topi non trattati.
