Impatto della privazione e della riossigenazione ossigeno-glucosio sulle interazioni cellula-cellula

Abstract

Fonte: Alluri, H., et.al. Deprivazione e riossigenazione di ossigeno-glucosio come modello di lesione da ischemia-riperfusione in vitro per lo studio della disfunzione della barriera emato-encefalica. J. Vis. Exp. (2015).

Il video dimostra l'impatto della privazione di ossigeno-glucosio e della successiva riossigenazione sulle cellule endoteliali microvascolari del cervello di ratto (RBMEC) simulando condizioni ipossiche e prive di nutrienti. Queste condizioni provocano la deplezione dell'ATP, l'aumento del calcio intracellulare e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che degradano le proteine della giunzione cellulare e inducono la formazione di fibre da stress, indebolendo così le interazioni cellula-cellula.

Protocollo

1. Inseminazione delle cellule endoteliali

1. Ottenere colture primarie di RBMEC da ratti adulti di Sprague Dawley (o ottenerle commercialmente).

2. Coltivare RBMEC in piastre di Petri rivestite di fibronectina da 100 cm (50 μg/ml) utilizzando il terreno di crescita delle cellule endoteliali del cervello di ratto. Cambia il mezzo ogni due giorni fino a raggiungere la confluenza.

3. Al raggiungimento dell'80-90% di confluenza, lavare delicatamente le cellule in 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) agitandole. Le cellule vengono quindi staccate esponendole a 1 ml di soluzione calda di tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) allo 0,25%, bilanciata a 37 °C.

4. Incubare le cellule a 37 °C per 2-5 minuti fino a quando le cellule non si sono staccate e disperse. NOTA: Toccare il piatto di coltura per staccare le cellule. Osserva le cellule al microscopio per confermare il completo distacco delle cellule dalla superficie del piatto.

5. Aggiungere 5 ml di terreno completo alla capsula di Petri per neutralizzare la tripsina. Pipettare il terreno contenente le cellule staccate e raccoglierlo in una provetta da centrifuga da 15 ml.

6. Centrifugare il terreno contenente cellule endoteliali a 220 x g per 5 minuti.

7. Aspirare il surnatante e conservare le cellule contenenti il pellet. Sospendi il pellet in 3-5 ml di terreno di coltura delle cellule endoteliali del cervello di ratto fresco mescolandolo delicatamente su e giù con una pipetta. Le cellule saranno poi contate utilizzando un contatore automatico di cellule o un emocitometro.

8. Trasferire la sospensione cellulare in un sistema di vetrini a camera sterile a 8 pozzetti prerivestito con fibronectina (50 μg/ml), 0,7 cm²/pozzetto con una densità di semina compresa tra 10.000 e 15.000 cellule per pozzetto. Far crescere le cellule a 37 °C fino a raggiungere la confluenza NOTA: Per eseguire western blot o altri esperimenti, le cellule possono essere coltivate in piastre di coltura cellulare di 10 cm o in piastre speciali come richiesto dall'esperimento.

2. Modello in vitro di deprivazione-riossigenazione di ossigeno e glucosio

1. Utilizzare il sistema di coltura cellulare ipossia per studiare gli effetti dell'OGD-R sui RBMEC (vedi Figura 1). Impostare e calibrare il sistema di coltura cellulare ipossia prima di iniziare l'esperimento, secondo le istruzioni del produttore.

2. Rimuovere i vetrini della camera confluente (passaggio 1.8) dall'incubatore a 37 °C. Sostituire l'intero terreno nel vetrino della camera con il Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) deossigenato, senza glucosio, e posto in camera di ipossia con il 95% di azoto e il 5% di anidride carbonica per 2 ore a 37 °C, per rappresentare la condizione OGD.

3. Spostare nuovamente le cellule nell'incubatore con il 95% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica a 37 °C e provviste di terreno completo di cellule endoteliali di cervello di ratto fresche e incubare per un'altra 1 ora a 37 °C.

NOTA: Questo passaggio rappresenta una situazione di riossigenazione.

Risultati

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, vetrini	Thermo scientific	177402
Secondario anti-coniglio con tag FITC anticorpo	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Qualsiasi altro PBS disponibile può essere utilizzato