Immunoprecipitazione nativa della cromatina delle cellule della neurosfera

Abstract

Fonte: Mendez, F. M. et al., Immunoprecipitazione della cromatina nativa utilizzando neurosfere tumorali cerebrali mure. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra l'isolamento di complessi proteina-DNA da cellule della neurosfera derivate da un tumore cerebrale di topo utilizzando l'immunoprecipitazione nativa della cromatina. Descrive in dettaglio le fasi per la preparazione della cromatina, l'immunoprecipitazione, il lavaggio e la digestione delle proteine per rilasciare il DNA per l'analisi a valle.

Protocollo

1. Immunoprecipitazione nativa della cromatina (ChIP)

1. Preparazione della cromatina
   1. Dopo aver creato lo stock di cellule della neurosfera (NS) derivate, coltivare NS in un pallone T-75 in 15 mL di terreno NSC a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale con un'atmosfera di 95% aria e 5% CO₂ fino a quando NS diventa confluente. Una piastra T-75 confluente produrrà 3-5 X 10⁶ celle.
   2. Quando le cellule diventano confluenti, centrifugare NS a 300 x g per 5 minuti, decantare il surnatante e aggiungere 1 mL di terreno di dissociazione cellulare. Incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti. Aggiungere 5 mL di terreno e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
      NOTA: Sono necessarie 1 x 10⁶ cellule per reazione di immunoprecipitazione (IP). Si noti che deve essere incluso anche un siero pre-immune o un controllo delle IgG.
   3. Centrifugare l'NS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL a 300 x g per 5 minuti, decantare il surnatante e risospendere il pellet NS con 1 mL di soluzione salina bilanciata e trasferire la sospensione in provette da microcentrifuga da 1,5 mL a basso legame proteico.
   4. Centrifugare NS a 300 x g per 5 minuti, decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 95 μL di tampone di digestione (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl₂, 0,2% polietilenglicole ottilfeniletere) per 1 x 10⁶ cellule integrate con cocktail di inibitori della proteasi ad alta concentrazione (1:100). Pipettare immediatamente le cellule su e giù per evitare la formazione di grumi ed evitare la formazione di bolle.
   5. Risospendere la nucleasi micrococcica (MNasi) in glicerolo al 50% per ottenere una soluzione di 1 mg/mL (1,15 unità/μL, conservata a -20 °C) che verrà indicata come stock "1x". Preparare un brodo "0,1x" eseguendo una seconda diluizione 1:9 con glicerolo al 50% (e.g., 900 μL di MNasi "1x" e 100 μL di glicerolo al 50%) e conservarlo a -20 °C.
   6. Mescolare 5 μL di MNasi "0.1x" e 145 μL di tampone per la digestione. Mantieni l'enzima sempre sul ghiaccio. Aggiungere 5 μl di MNasi diluita nel tampone di digestione per 1 x 10⁶ cellule. Agitare il tubo per mescolare e posizionare il tubo in un blocco a 37 °C per esattamente 12 minuti. Elaborare i campioni uno alla volta per garantire un tempo di incubazione accurato di 12 minuti.
   7. Aggiungere 10 μL di 10x MNase Stop Buffer (110 mM Tris-HCl, pH 8.0, 55 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)) per 1 x 10⁶ cellule. I campioni devono essere conservati in ghiaccio da questo punto in poi.
   8. Aggiungere 110 μl di "tampone tampone per test di radioimmunoprecipitazione (RIPA)" (280 mM di NaCl, 1,8% di polietilenglicole ottilfeniletere, 0,2% di dodecil solfato di sodio (SDS), 0,2% di Na-desossicolato, 5 mM di glicole etilenico (β-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA); conservato a 4 °C) integrato con cocktail di inibitori della proteasi ad alta concentrazione (1:100) per 1 x 10⁶ cellule. Muovi il tubo per mescolare.
   9. Centrifugare le provette per 15 minuti in microfuge a 4 °C e 1700 x g. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml (non sono più necessarie provette per microcentrifuga a basso legame proteico) e conservarle in ghiaccio. Scartare il pellet.
      
2. Immunoprecipitazione (IP)
   1. Mescola le perle magnetiche della proteina A e della proteina G in un rapporto 1:1. Per ogni IP, preparare 25 μL di perline.
   2. Lavare le perle aggiungendo 1 mL di tampone RIPA (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% polietilenglicole ottilfenil etere, 0,1% SDS, 0,1% Na-desossicolato; conservato a 4 °C) integrato con inibitori della proteasi a bassa concentrazione (1:1000).
   3. Utilizzare un magnete per consentire alle perline di separarsi dalla soluzione di lavaggio e travasare la soluzione di lavaggio (circa 1 minuto). Eseguire la fase di lavaggio due volte.
   4. Risospendere le perle al volume originale utilizzando il tampone RIPA integrato con inibitori della proteasi (1:1000).
   5. Se necessario, diluire la cromatina utilizzando un tampone RIPA integrato con inibitori della proteasi (1:1000) in modo che ogni IP abbia un volume di 100-200 μL. Riservare il 10% del volume utilizzato per IP di cromatina per l'input.
      NOTA: Ad esempio, se vengono utilizzati 200 μL per IP, 20 μL di cromatina diluita dovrebbero essere riservati per l'input. Per un totale di quattro IP, il volume totale della cromatina deve essere diluito a 820 μL.
   6. Preparare l'input. Aggiungere 100 μL di tampone TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) integrato con proteinasi K (0,5 mg/mL) all'input e incubare l'input a 55 °C per 1 h.
   7. Purificare l'input utilizzando un kit di purificazione con reazione a catena della polimerasi (PCR) seguendo le istruzioni del produttore ed eluire in 50 μl di tampone di eluizione fornito nel kit.
   8. Misurare la concentrazione dell'input utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi e registrare i risultati su un notebook. Blank con tampone di eluizione dal kit.
      NOTA: Nelle neurosfere di topo, abbiamo usato circa 6 μg di DNA per ogni IP.
   9. Eseguire l'input su un gel all'1% o caricare 1 μl su un bioanalizzatore di DNA utilizzando le impostazioni standard. Conservare il resto per utilizzarlo come input nelle applicazioni downstream.
   10. Aggiungere 10 μL di microsfere magnetiche di proteina A e G lavate per ogni IP e incubare IP per 1 ora a 4 °C.
       NOTA: Ad esempio, aggiungere 30 μL di microsfere magnetiche di proteina A e G per tre IP.
   11. Posizionare i campioni su un magnete e lasciare che le perline si separino. Dividere la cromatina trasferendo la quantità precedentemente determinata in una nuova provetta da 1,5 mL.
   12. Aggiungere l'anticorpo e avvolgere i tappi con pellicola di paraffina di plastica per evitare l'evaporazione. Incubare i campioni per una notte a 4 °C con rotazione a 20 giri/min.
       NOTA: La concentrazione dovrebbe essere determinata empiricamente seguendo le raccomandazioni del produttore.
   13. Il giorno successivo, centrifugare le provette con una mini centrifuga a temperatura ambiente, 2000 x g, per 10 s. Quindi, aggiungere 10 μL di microsfere a ciascun IP e incubare IP per 3 ore a 4 °C con rotazione a 20 giri/min.
       
3. Lavaggi IP e digestione delle proteine
   1. Aggiungere 150 μL di tampone RIPA integrato con inibitori della proteasi a bassa concentrazione (1:1000) a ciascun IP e incubare IP a 4 °C con rotazione a 20 rpm per 5 min. Posizionare il campione su un supporto magnetico e lasciare che le perle magnetiche si separino. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante. Ripeti questo passaggio cinque volte.
   2. Aggiungere 150 μL di tampone cloruro di litio (LiCl) (250 mM LiCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% Na-desossicolato; conservare a 4 °C) integrato con inibitori della proteasi a bassa concentrazione (1:1000) a ciascuna IP e incubare IP a 4 °C con rotazione a 20 rpm per 5 min. Posizionare il campione su un supporto magnetico e lasciare che le perle magnetiche si separino. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante.
   3. Aggiungere 150 μl di Tris-EDTA (TE) freddo (senza inibitori della proteasi) e incubare il campione a 4 °C con rotazione a 20 giri/min per 5 minuti. Posizionare il campione su un supporto magnetico e lasciare che le perle magnetiche si separino. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante.
   4. Dopo l'ultima fase di lavaggio, risospendere il campione in 100 μL di tampone TE integrato con proteinasi K (0,5 mg/mL) e incubare il campione a 55 °C per 1 ora.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2946-90004bioanalyzerAccuSpin Micro 17R, refrigeratoFisher Scientific13-100-676 C57BL/6TaconicB6-fC57BL/6 mouseCloruro di Calcio<td style='bordo-fondo:1px solido #000000;bordo-destro:1px solido #000000;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:basso;'>Aldrich22350-6buffer reagentD-Luciferin, Sale di PotassioGoldbioLuckK-1gDiaMag1.5 rack magneticoDiagenodeB04000003per lavaggi di perline magneticheDiaMag Rotator EUDiagenodeB05000001rotatorDMEM/F-12Gibco11330-057NSC component<tr style='altezza:19px;'>Dynabeads Protein AThermo Fisher Scientific10001Dproteina A perline magneticheDynabeads Protein GThermo Fisher Scientific10003Dperline magnetiche protein GEGFPeproTechAF-100-15preparare 20 μg/mL stock in 0,1% BSA e aliquota.Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)SigmaE-4884buffer reagentEthylenglicol-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico) (EGTA)SigmaE-4378buffer reagentSiero fetale bovino<td style='border-bottom:1px solido #000000;border-right:1px solido #000000;overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Gibco10437028per congelare le celleFGFPeproTech100-18bPrepara 20 μg/mL di stock in 0,1% BSA e aliquota.ForcipeStrumenti di Fine Science11008-13per la dissezione del tumoreGlicerolo, MB GradeEMD- Millipore356352 HBSSGibco14175-103soluzione salina bilanciataFlurisoVETone501017anestetico per inalazioneIvis SpectrumPerkin-Elmer124262sistema di imaging ottico in vivoHyqtaseHyClonSV3003001supporto di distacco cellulareCloruro di litio<td style='bordo-fondo:1px solido #000000;bordo-destro:1px solido #000000;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:basso;'>SigmaL8895buffer reagentMicrotubi a basso legameCorning CostarCLS3207basso Tubo per microcentrifuga legante proteineTubo per microcentrifugaFisher21-402-903normale provetta per microcentrifugaNucleasi micrococcicaThermo Fisher Scientific, Affymetrix70196Yogni lotto può differire; Acquista una quantità sufficiente per esperimenti e aliquota.N2Gibco17502-048componente NSCNormocinInvivogenNOL-36-063<td style='bordo-fondo:1px solido #000000;bordo-destro:1px solido #000000;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento verticale:fondo;'>agente antimicrobico, utilizzare a 0.1 mg/mL.NP-40 (Igepal CA-630)Sigma18896-50MLbuffer reagentPestello a pellet Kimble KontesFisher ScientificK749515-0000 Cocktail Inibitore della Proteasi<td style='bordo-fondo:1px solido #000000;bordo-destro:1px solido #000000;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:fondo;'>Sigma-AldrichP8340aliquot e conservare a -20 °C.Protinasi KSigma-AldrichP2308fare 10 mg/mL di stock in acqua; aliquotare e conservare a -20 °C.Kit di purificazione PCR QIAquickQiagen28104Kit di purificazione del DNAScalpelStrumenti di Fine Science10007-16per la dissezione del tumoreCloruro di sodioVWR0241-5KGreagente tamponeSodio desossicolato<td style='bordo-fondo:1px solido #000000;bordo-destro:1px solido #000000;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento verticale:fondo;'>Sigma-AldrichD670-25Gbuffer reagentSodio Dodecil solfato (SDS)SigmaL-4390buffer reagentTris BaseThermo Fisher ScientificBp152-1reagente bufferTriton X-100Thermo Fisher ScientificBP 151-500polietilenglicole ottilfenile-etereStandard Mini CentrifugeFisherbrand12-006-901Standard Mini CentrifugeSZX16 microscopioOlimpoSZX16microscopio da dissezione fluorescenteNanodrop OneThermo-Fisher ScientificND-ONEC-W