Esecuzione dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per rilevare l'espressione genica nelle sezioni cerebrali di topo

Abstract

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinazione di ibridazione a doppia fluorescenza in situ con immunomarcatura per il rilevamento dell'espressione di tre geni in sezioni cerebrali di topo. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video dimostra l'uso dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per visualizzare l'espressione di due bersagli di RNA in sezioni cerebrali di topo. Il protocollo prevede il rilevamento sequenziale dell'RNA utilizzando sonde marcate con isotiocianato di fluoresceina e digossigenina, seguito dall'amplificazione del segnale enzimatico per migliorare la sensibilità. La fluorescenza risultante consente l'analisi di co-localizzazione degli RNA bersaglio all'interno del tessuto.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Ibridazione

1. Preparare un tampone di lavaggio a 65 °C: 150 mM NaCl, 15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x citrato di sodio salino), 50% (v/v) formamide e 0,1% (v/v) Tween-20.
2. Preparare il ta....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	per il lavaggio a 65°C buffer
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Siero di pecora inattivato a caldo	Sigma	S2263
Penna idrofobica	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal style	Leica
.22 μM filter	Millex	SLGP033RS
Deionized formamide	Sigma	F9037	per il buffer di blocco ISH
Cloruro di sodio	Sigma	S3014
Acido cloridrico	VWR International	20252.29
Sodium phosphate monobasic anhydrous	Sigma	S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	30435
Yeast tRNA	Roche	10109495001
50x La soluzione di Denhardt	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Sodium acetate	Sigma	S2889
Trizma Base	Sigma	T1503