Esecuzione dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per rilevare l'espressione genica nelle sezioni cerebrali di topo

Abstract

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinazione di ibridazione a doppia fluorescenza in situ con immunomarcatura per il rilevamento dell'espressione di tre geni in sezioni cerebrali di topo. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video dimostra l'uso dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per visualizzare l'espressione di due bersagli di RNA in sezioni cerebrali di topo. Il protocollo prevede il rilevamento sequenziale dell'RNA utilizzando sonde marcate con isotiocianato di fluoresceina e digossigenina, seguito dall'amplificazione del segnale enzimatico per migliorare la sensibilità. La fluorescenza risultante consente l'analisi di co-localizzazione degli RNA bersaglio all'interno del tessuto.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Ibridazione

1. Preparare un tampone di lavaggio a 65 °C: 150 mM NaCl, 15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x citrato di sodio salino), 50% (v/v) formamide e 0,1% (v/v) Tween-20.
2. Preparare il tampone MABT: 100 mM di acido maleico, 150 mM di NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20, pH 7,5.
3. Diluire le due sonde (marcate con DIG e FITC) 1/1.000 in tampone di ibridazione (acqua deionizzata trattata con DEPC con il 50% (v/v) di forma deionizzata, 200 mM di NaCl, 5 mM di EDTA, 10 mM di Tris-HCl pH 7,5, 5 mM di NaH₂PO₄, 5 mM di Na₂HPO₄, 0,01 mg/ml di tRNA di lievito, 1× soluzione di Denhardt e 10% p/v destrano solfato) preriscaldati a 65 °C e mescolare bene.
4. Applicare circa 300 μl di miscela di ibridazione su ciascun vetrino, vetrino coprioggetti con vetrini coprioggetti cotti in forno (200 °C) e incubare O/N a 65 °C in una camera umidificata.
5. Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente un tampone di lavaggio preriscaldato. Lavare i vetrini per 30 minuti due volte a 65 °C con tampone di lavaggio.
6. Lavare le diapositive per 10 minuti tre volte con MABT a RT.

2. Visualizzazione della sonda FITC

1. Preparare il tampone bloccante ISH: MABT con il 2% di reagente bloccante e il 10% di siero di pecora inattivato termicamente.
2. Opzionale: utilizzare una penna idrofobica per disegnare cerchi attorno alle sezioni di tessuto sul vetrino per ridurre il volume delle soluzioni anticorpali necessarie.
3. Incubare i vetrini per 1 ora a RT con tampone di blocco ISH in una camera umidificata.
4. Incubare i vetrini O/N a 4 °C con un anticorpo anti-FITC coniugato con perossidasi di rafano (POD) diluito 1/500 (v/v) in tampone bloccante ISH.
5. Posizionare i vetrini in un barattolo Coplin contenente PBS con lo 0,1% (v/v) di Tween-20 (PBST). Lavare 3 volte per 10 minuti in PBST e sostituire ogni volta con PBST fresco.
6. Immediatamente prima dell'uso, preparare la tiramide fluorescente diluendo 100 volte nel diluente Amplification. Per questo esempio, utilizzare FITC-tiromide.
7. Aggiungere questo ai vetrini e lasciare agire per 10 minuti a RT.
8. Posizionare i vetrini in un barattolo di Coplin e lavare 3 volte in PBST per 10 minuti.

3. Visualizzazione della sonda DIG

1. Preparare 0.1 m tris-HCl pH 8.2.
2. Incubare i vetrini con un tampone bloccante ISH per 1 ora a RT.
3. Incubare i vetrini O/N a 4 °C con un anticorpo anti-DIG coniugato con fosfatasi alcalina (AP) diluito 1/1.500 (v/v) in tampone bloccante ISH.
4. Lavare con MABT per 10 minuti tre volte.
5. Lavare due volte con Tris-HCl 0,1 M pH 8,2 per 5 minuti a RT.
6. Immediatamente prima dell'uso, preparare la soluzione Fast Red sciogliendo le compresse in Tris 0,1 M pH 8,2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μM.
7. Incubare i vetrini a 37 °C con la soluzione Fast Red in una camera umidificata. Poiché il tempo per uno sviluppo ottimale varia, controllare regolarmente i vetrini con un microscopio a fluorescenza per monitorare la formazione di precipitato. Per questo esempio, interrompere la reazione dopo 2 - 3 ore.
8. Lavare con PBST per 10 minuti tre volte.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	per il lavaggio a 65°C buffer
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Siero di pecora inattivato a caldo	Sigma	S2263
Penna idrofobica	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal style	Leica
.22 μM filter	Millex	SLGP033RS
Deionized formamide	Sigma	F9037	per il buffer di blocco ISH
Cloruro di sodio	Sigma	S3014
Acido cloridrico	VWR International	20252.29
Sodium phosphate monobasic anhydrous	Sigma	S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	30435
Yeast tRNA	Roche	10109495001
50x La soluzione di Denhardt	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Sodium acetate	Sigma	S2889
Trizma Base	Sigma	T1503