Colorazione in immunofluorescenza di tessuto fibrovascolare malato derivato da pazienti con inclusione in gel

Abstract

Fonte: Gucciardo, E., et. al., Un modello di coltura tissutale ex vivo per le complicanze fibrovascolari nella retinopatia diabetica proliferativa. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video descrive in dettaglio un protocollo di immunocolorazione per colture ex vivo di tessuto fibrovascolare incorporato in gel di fibrina. Ciò consente una visualizzazione dettagliata delle alterazioni vascolari associate alla retinopatia diabetica proliferativa

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Colorazione in immunofluorescenza a montaggio intero

NOTA: Questo protocollo dura 5 giorni e può essere interrotto con incubazioni notturne dove indicato. Non lasciare asciugare i gel di fibrina in nessun momento. Tutti i passaggi vengono eseguiti presso RT se non diversamente indicato.

1. Prepara le seguenti soluzioni prima di iniziare il protocollo di colorazione.
   1. Soluzione post-fissazione: preparare una soluzione 50:50 di acetone:metanolo mescolando quantità uguali di acetone e metanolo (ad esempio, 50 mL). Conservare a -20 °C. Preparare questa soluzione al più tardi il giorno prima della colorazione. Questa soluzione può essere conservata nuovamente a -20 °C ed essere utilizzata per le colorazioni successive.
      NOTA: Prepara questa soluzione nella cappa aspirante poiché l'acetone e il metanolo sono infiammabili e pericolosi per la salute.
   2. Soluzione bloccante: preparare una soluzione di etossilato di fenolo ottilico al 15% di siero fetale bovino (FBS) al 15% in PBS aggiungendo prima il 15% di FBS al PBS. Aggiungere l'ottilfenolo etossilato e mescolare per sciogliere. Conservare a 4 °C.
      NOTA: Questa soluzione può essere preparata in grandi quantità in anticipo, conservata in aliquote da 15 mL a -20 °C e scongelata prima dell'uso il giorno in cui viene avviato il protocollo di colorazione. Utilizzare aliquote appena preparate o appena scongelate per ogni protocollo di colorazione.
   3. Soluzione di lavaggio: Prepara 1 L di PBS integrato con 0,45% di ottilfenolo etossilato aggiungendo 4,5 ml di ottilfenolo etossilato a 995,5 ml di PBS. Mescolare per sciogliere. Negozio presso RT.
2. Solleva con cautela le goccioline dalla piastra usando una spatola in acciaio inossidabile con bordi quadrati. Staccare la gocciolina prima dai bordi prima di sollevare il centro e trasferirla in un pozzetto di piastra a 12 pozzetti contenente 1 mL di PBS.
   NOTA: Esegui i passaggi di post-fissazione, lavaggi e blocco in questo formato di targa.
3. Post-fix le goccioline con 1 mL di soluzione ghiacciata di acetone:metanolo 50:50 per ~1 min (il bordo delle goccioline diventerà bianco).
   NOTA: Esegui questo passaggio nella cappa aspirante poiché l'acetone e il metanolo sono pericolosi per la salute.
4. Risciacqua con 3 - 5 lavaggi in 2 ml di PBS (le goccioline affonderanno nella soluzione PBS quando la reidratazione è completa).
   NOTA: Evita di toccare le goccioline con la punta della pipetta poiché, dopo la post-fissazione, sono appiccicose sulla plastica. Durante tutto il protocollo, evitare di aspirare soluzioni post-fissate, anticorpali, bloccanti e lavanti mediante aspirazione, in quanto ciò potrebbe danneggiare o distruggere completamente le goccioline. Invece, inclinare la piastra e rimuovere con cura le soluzioni utilizzando una pipetta da 500-5.000 μl.
5. Centrifuga la soluzione bloccante per 15 minuti a 21.000 x g e 4 °C per rimuovere i detriti.
   NOTA: La soluzione può essere aliquotata in provette da 1,5 ml per la centrifugazione. La soluzione non utilizzata può essere conservata a 4 °C e utilizzata per tutte le fasi successive.
6. Incuba le goccioline in una soluzione bloccante da 500 μL per 2 ore a RT.
   NOTA: Per ridurre il volume della soluzione bloccante utilizzata, la piastra può essere inclinata su un supporto e possono essere utilizzati fino a 300 μL di soluzione/gocciolina.
7. Prepara la miscela di anticorpi primari (almeno 30 μL/gocciolina) alla diluizione appropriata in soluzione bloccante e centrifuga per 15 minuti a 21.000 x g e 4 °C.
8. Trasferisci le goccioline in una piastra rotonda a 96 pozzetti con fondo a U utilizzando una spatola arrotondata e incuba con almeno 30 μL/gocciolina della miscela di anticorpi primari durante la notte a 4 °C.
9. Il giorno seguente, trasferisci le goccioline in una piastra da 12 pozzetti contenente 2 ml di soluzione di lavaggio/pozzetto, risciacqua prima con tre lavaggi da 5 minuti e poi con nove lavaggi da 30 minuti. Lasciare l'ultimo lavaggio (2 mL) per una notte a 4 °C.
10. Il giorno seguente, risciacqua tre volte con PBS e trasferisci le goccioline in una piastra rotonda a 96 pozzetti con fondo a U.
11. Durante i lavaggi, preparare l'appropriata miscela di anticorpi secondari coniugati fluoroforici (diluita 1:500, almeno 30 μL/gocciolina) in soluzione bloccante e centrifugare per 15 minuti a 21.000 x g e 4 °C.
12. Trasferisci le goccioline in una piastra rotonda a 96 pozzetti con fondo a U utilizzando una spatola arrotondata e incuba con almeno 30 μL della miscela di anticorpi secondari, per 4 ore a RT, al riparo dalla luce.
    NOTA: Esegui tutte le successive incubazioni e fasi di lavaggio al riparo dalla luce.
13. Trasferisci le goccioline in una piastra da 12 pozzetti contenente 2 ml di soluzione di lavaggio/pozzetto usando una spatola dai bordi arrotondati, risciacqua prima con tre lavaggi da 5 minuti e poi con quattro lavaggi da 30 minuti. Lasciare l'ultimo lavaggio (2 mL) per una notte a 4 °C.
14. Il giorno seguente, risciacqua i gel con cinque lavaggi di 30 minuti e poi tre volte con PBS. Lasciare l'ultimo lavaggio (2 mL) per una notte a 4 °C.
15. Il giorno seguente, trasferisci le goccioline in una piastra rotonda (U)-bottom a 96 pozzetti utilizzando una spatola arrotondata e contrasta i nuclei incubando con 10 μg/mL di colorazione nucleare Hoechst (almeno 30 μL/gocciolina) per 30 minuti a RT.
    NOTA: In alternativa è possibile utilizzare un mezzo di montaggio integrato con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per la controcolorazione dei nuclei. In tal caso, questo passaggio e il passaggio 1.16 vengono saltati, procedendo direttamente al passaggio 1.17.
16. Trasferisci le goccioline in una piastra da 12 pozzetti contenente 2 ml di PBS/pozzetto usando una spatola arrotondata e risciacqua tre volte con PBS.
17. Monta le goccioline sul vetrino del microscopio come segue:
    1. Applica uno strato stretto di mezzo di montaggio a indurimento rapido sui bordi di un coprioggetto di forma quadrata da 22 mm x 22 mm e lascia asciugare per ~1 minuto. Eseguire questo passaggio per ogni goccia singolarmente, per evitare un indurimento eccessivo del mezzo di montaggio.
       NOTA: Esegui questo passaggio nella cappa aspirante poiché il mezzo di montaggio a indurimento rapido è pericoloso per la salute.
    2. Risciacqua la gocciolina immergendola in un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti contenente 2 ml di acqua deionizzata e trasferiscila su un vetrino da microscopio, usando una spatola arrotondata. Rimuovere l'acqua in eccesso utilizzando un piccolo pezzo di carta assorbente.
    3. Eroga 15 μL di mezzo di montaggio anti-sbiadimento non indurente sulla gocciolina.
       NOTA: In alternativa, se non è stata utilizzata la colorazione nucleare di Hoechst, è possibile utilizzare un mezzo di montaggio contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
    4. Posiziona delicatamente il vetro di copertura, con il mezzo di montaggio a indurimento rapido rivolto verso il vetrino microscopico, sopra la goccia e lascia depositare.
       NOTA: Il mezzo a indurimento rapido si attaccherà al vetrino microscopico e manterrà la gocciolina in posizione.
18. Ripeti il passaggio 1.17 per tutte le goccioline. Montare due goccioline su ciascun vetrino del microscopio.
19. Lascia asciugare i vetrini all'aria a RT per ~2 h e conservali a 4 °C durante la notte. Assicurarsi che le guide siano posizionate orizzontalmente e protette dalla luce.
20. Immagine le colture FT ex vivo native o end-point colorate utilizzando un microscopio confocale o un microscopio a epifluorescenza verticale dotato di una funzione di sezionamento ottico e obiettivo 20x o 40x. Usa la funzione piastrella per catturare un'area più ampia del tessuto in una sola volta.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Material
Piastre per colture cellulari, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Utilizzato per l'immunofluorescenza
Spatole rotonde/piatte, acciaio inossidabile	VWR	82027-528	Utilizzato per l'immunofluorescenza a montaggio intero
Vetrini coprioggetti 22x22mm #1	Menzel/Fisher	15727582	Utilizzato per il montaggio
Vetrini per microscopio	Fisher	Kindler K102	Utilizzato per il
Carta assorbente	VWR	115-0202	Utilizzato per il montaggio
Compresse PBS	Medicago	09-9400-100	Utilizzato per preparare 1x PBS
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M<
Metanolo	Sigma-Aldrich	32213	Utilizzato per preparare la soluzione post-fissazione. TOSSICO: indossare guanti e/o indumenti protettivi. Utilizzo in cappa aspirante.
Triton X-100 (ottilfenolo etossilato)	Sigma-Aldrich	T9284	Utilizzato per l'immunofluorescenza a montaggio intero. NOCIVO: indossare guanti e/o indumenti protettivi.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	Per la controcolorazione dei nuclei. NOCIVO: indossare guanti e/o indumenti protettivi e proteggere gli occhi e/o il viso.
VECTASHIELD Antifade Montaggio Medium	Vector Laboratories	H-1000	Indossa guanti e/o indumenti protettivi e proteggi gli occhi. Utilizzo in cappa aspirante.
Supporto di montaggio antisbiadimento VECTASHIELD con DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Mezzo di montaggio con controcolorazione dei nuclei. Indossare guanti e/o indumenti protettivi e proteggere gli occhi. Utilizzo in cappa aspirante.
Eukitt Supporto di montaggio a indurimento rapido	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOSSICO: Indossa guanti e/o indumenti protettivi e protezione per gli occhi. Utilizzo in cappa aspirante.
VEGFA umano ricombinante	R&D Systems	293-VE-010	50 ng/ mL concentrazione
VEGFC umano ricombinante	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL concentrazione finale
TGFβ	Millipore	GF346	1 ng/ mL concentrazione
Recombinant human bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL concentrazione
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Usato a diluizione 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Usato a 1:100 diluizione, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Utilizzato a diluizione 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Used at 1:100 diluition, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab<
Segnalazione cellulare	9664	Utilizzato a diluizione 1:200, Capra anti Coniglio Alexa 594 Secondario Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Utilizzato a diluizione 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	Utilizzato a diluizione 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Utilizzato a diluizione 1:1500, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	Sistemi di ricerca e sviluppo	AF2089	Utilizzato a diluizione 1:100, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Utilizzato a diluizione 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Usato a 1:200 di diluizione, Capra anti Coniglio Alexa 568 Secondario Ab
Prox1	Sistemi di ricerca e sviluppo	AF2727	Usato a 1:40 diluizione, Pollo anti Goat Alexa 594 Secondario Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Utilizzato a diluizione 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	Utilizzato a diluizione 1:400, Cy3 coniugato
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202<
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Utilizzato a 1:500 diluizione
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo Scientific	A-11057	Utilizzato a 1:500 diluizione
Alexa Fluor568 Capra anti-Coniglio IgG	Thermo Scientific	A-11036	Utilizzato a 1:500 diluizione
Alexa Fluor594 Pollo Anti-Capra IgG	Sonde molecolari	A-21468	Usato a 1:500 diluizione
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopi<
Microscopio a epifluorescenza invertito Axiovert 200	Zeiss		Per l'imaging del FT
AxioImager.Z1 microscopio a epifluorescenza verticale con Apotome	Zeiss		Per l'imaging di FT immunocolorato a montaggio intero

a montaggio intero montaggiotd style='larghezza:194pt;' >Utilizzato per preparare la soluzione post-fissazione. NOCIVO: indossare guanti e/o indumenti protettivi. Utilizzo in cappa aspirante. finale finale finaletd style='height:15.75pt;width:165pt;'>Caspasi fensa-3 (5A1E)td style='width:194pt;'>Utilizzato a 1:500 diluizionetd style='width:174pt;'>