Immunocolorazione dei neuroni in fette di cervello di topo dopo ibridazione in situ a fluorescenza

Abstract

Fonte: Baleriola, J., et. al., Rilevamento di mRNA localizzati assonalmente in sezioni cerebrali utilizzando l'ibridazione in situ ad alta risoluzione. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra il rilevamento dell'mRNA all'interno degli assoni colinergici in fette fisse di ippocampo di topo utilizzando l'ibridazione fluorescente in situ e la colorazione degli anticorpi. La microscopia a fluorescenza rivela la localizzazione spaziale degli mRNA marcati con sonda e della colina acetiltransferasi nei neuroni colinergici.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Test FISH seguito da immunoistochimica utilizzando l'unmasking dell'antigene/RNA indotto dal calore
   Prima di iniziare, prepara tutto il materiale richiesto:
   1. Riscaldare il forno di ibridazione a 40 °C e inserire nel forno una teglia contenente acqua distillata per creare un ambiente umidificato.
   2. Prendi una scatola di diapositive e metti dei tovaglioli di carta imbevuti di acqua distillata all'interno per umidificarla. Quindi, posizionare la scatola di scorrimento nel forno di ibridazione.
   3. Rimuovi le sonde (sia negative che target) dal frigorifero e scaldale nel forno di ibridazione per 10 minuti. Quindi, lasciare raffreddare le sonde a RT.
   4. Equilibra i reagenti di amplificazione AMP 1-4 (inclusi nel kit di reagenti Multiplex fluorescenti) su RT.
   5. Prepara la soluzione per il recupero dell'antigene: 10 mM di citrato di sodio (pH 6), 0,05% Tween 20. Nota: La soluzione può essere conservata a RT a tempo indeterminato ed essere utilizzata per future colorazioni.
   6. Prepara 1x tampone di lavaggio diluendo la soluzione madre 50x (nel kit di reagenti Multiplex fluorescenti) in acqua priva di RNasi o trattata con DEPC.
      NOTA: 1x tampone di lavaggio può essere conservato a RT per 1 mese ed essere utilizzato per future macchie. 50x tampone di lavaggio potrebbe precipitare. In tal caso, riscaldare 50 volte il tampone di lavaggio a 40 °C per 10 minuti prima di preparare la soluzione 1 volta.
   1. Rimuovi i vetrini dal 100% di etanolo e asciugali all'aria per 5 minuti a RT.
   2. Prepara un barattolo di coplin contenente 50 ml di soluzione per il recupero dell'antigene. Immergere i vetrini nella soluzione di recupero dell'antigene e farli bollire per 10 minuti in un forno a microonde.
      NOTA: In alternativa, posiziona i vetrini orizzontalmente in un piatto di vetro rotondo di 100 mm di diametro contenente 100 ml di soluzione di recupero.
      1. Riempi un bicchiere da 1 litro con acqua distillata e mettilo nel microonde.
         NOTA: L'acqua "tamponerà" il calore durante l'esecuzione della smascheratura.
      2. Posiziona i vetrini nella soluzione di recupero dell'antigene all'interno del microonde. Far bollire le diapositive ad alta potenza per 5 min. Immediatamente dopo che i campioni hanno smesso di bollire, il calore scorre di nuovo ad alta potenza per altri 5 minuti.
      3. Raffredda le diapositive su RT.
         NOTA: PASSAGGIO CRITICO: la durata e la procedura di ebollizione dovrebbero essere determinate dall'utente, a seconda delle caratteristiche del microonde. Più velocemente inizia l'ebollizione, maggiori sono le possibilità di evaporazione della soluzione. In questo caso, si consiglia di far bollire i campioni per periodi di tempo più brevi più di due volte per completare un tempo totale di smascheratura di 10 minuti. Al contrario, se il riscaldamento viene eseguito a media o bassa potenza, lo smascheramento può essere eseguito una sola volta per 10 minuti. Tuttavia, se i campioni non bollono continuamente per un totale di circa 10 minuti, ciò potrebbe comportare lo smascheramento parziale sia dell'RNA bersaglio che della proteina da rilevare.
   3. Lava le diapositive tre volte con 1x PBS.
   4. Aggiungi 2 - 3 gocce (~100 μl) del set di sonda dapB a quelle fette di cervello utilizzate per valutare la colorazione di fondo. NOTA: Il set di sonde dapB mira a un gene batterico e non dovrebbe riconoscere alcun RNA di mammifero.
   5. Aggiungi 2 - 3 gocce del set di sonda di puntamento a quelle fette di cervello utilizzate per rilevare l'RNA di interesse. NOTA: in questo esempio viene utilizzato un set di sonde che ha come target i residui 20 - 1.381 dell'mRNA Atf4 di topo.
   6. Copri i vetrini con parafilm per evitare l'evaporazione della sonda, mettili nella scatola di vetrini umidificati all'interno del forno di ibridazione e incubali a 40 °C per 2 ore.
      NOTA: OPZIONALE: ulteriori fette di cervello possono essere ibridate con un set di sonde mirate al mouse Polr2A e utilizzate come controlli positivi.
   7. Lava le diapositive due volte con 1x wash buffer per 2 minuti a RT.
   8. Aggiungi 2 - 3 gocce di reagente di amplificazione AMP 1-FL a ogni fetta di cervello, copri i vetrini con parafilm, mettili nella scatola dei vetrini e incuba a 40 °C per 30 minuti nel forno di ibridazione.
   9. Lava le diapositive due volte con 1x wash buffer per 2 minuti a RT.
   10. Aggiungi 2 - 3 gocce di reagente di amplificazione AMP 2-FL a ogni fetta di cervello, copri i vetrini con parafilm, mettili nella scatola dei vetrini e incubali a 40 °C per 15 minuti nel forno di ibridazione.
   11. Lava le diapositive due volte con 1x wash buffer per 2 minuti a RT.
   12. Aggiungi 2 - 3 gocce di reagente di amplificazione AMP 3-FL a ogni fetta di cervello, copri i vetrini con parafilm, mettili nella scatola dei vetrini e incubali a 40 °C per 30 minuti nel forno di ibridazione.
   13. Lava le diapositive due volte con 1x wash buffer per 2 minuti a RT.
   14. Aggiungi 2 - 3 gocce di reagente di amplificazione AMP 4-FL a ogni fetta di cervello, copri i vetrini con parafilm, mettili nella scatola dei vetrini e incubali a 40 °C per 15 minuti nel forno di ibridazione.
   15. Lava le diapositive due volte con 1x wash buffer per 2 minuti a RT e due volte con 1x PBS.
   16. Aggiungere 100 - 200 μl (o un volume sufficiente a coprire completamente le fette) di una soluzione bloccante contenente 3 mg/ml di BSA, 100 mM di glicina e 0,25% di Triton X-100 in PBS (pH 7,4) ai vetrini, coprirli con parafilm e incubare per 30 minuti a RT.
   17. Aggiungi 100 - 200 μl di anticorpo anti-ChAT diluito in soluzione bloccante (1/100) ai vetrini, coprili con parafilm e incuba per 2 giorni a 4 °C. Assicurati che le fette di cervello non si secchino. Se necessario, riapplicare la soluzione di anticorpi anti-ChAT sulle fette di cervello 24 ore dopo l'incubazione.
   18. Lava le diapositive tre volte in 1x PBS per 5 minuti a RT.
   19. Aggiungi 100 - 200 μl dell'anticorpo secondario coniugato con Alexa appropriato (ad esempio, Alexa-594 asino anti-capra per questo particolare esempio) ai vetrini, copri con parafilm e incuba per 1 ora a RT.
   20. Lava le diapositive tre volte in 1x PBS per 5 minuti a RT.
   21. Lava le diapositive una volta con acqua distillata.
   22. Monta diapositive con un supporto di montaggio contenente DAPI.
   23. Visualizza le fette di cervello sotto un microscopio a fluorescenza.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Custom probe targeting residues 20-1381 del mouse Atf4 mRNA (NM_009716)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Sonda personalizzata che mira ai residui 15-1256 dell'mRNA ATF4 umano (NM_001675.2)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Negative control probe-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	Probe
Sonda di controllo positivo-mouse Polr2A (opzionale)	Advanced Cell Diagnostics	312471	Probe
Goat polyclonal anti-ChAT antibody	Millipore	AB144P
Mezzo di montaggio ProLong Gold con DAPI	Life Technologies	P36935
Kit di reagenti multiplex fluorescenti RNAscope (per il rilevamento della fluorescenza)	Advanced Cell Diagnostics	320850	Kit di ibridazione in situ