Imaging ad alta risoluzione dei recettori dei neurotrasmettitori nelle sinapsi retiniche

Abstract

Fonte: Zhang, J., et al. Analisi quantitativa ad alta risoluzione dell'immunooro dei recettori di membrana nelle sinapsi del nastro retinico. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra una tecnica di microscopia elettronica per visualizzare la localizzazione del recettore dei neurotrasmettitori nelle sinapsi retiniche. Le sezioni retiniche contengono cellule gangliari retiniche che esibiscono recettori dei neurotrasmettitori legati alla membrana e sono marcate con la subunità B della tossina del colera (CTB). Dopo aver marcato i marcatori con anticorpi coniugati con nanoparticelle d'oro e aver controcolorato la sezione con metalli pesanti, i recettori RGC vengono visualizzati al microscopio.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Fissazione del tessuto retinico

1. Assemblare i seguenti materiali e strumenti: un microscopio da dissezione, 2 pinze con punte molto sottili, forbici, carta da filtro in cellulosa, pipetta di plastica e un vetrino da microscopio.
2. Anestetizzare il ratto in una camera chiusa con 2,0 ml di alotano (un anestetico inalante). Determinare un'adeguata anestesia con questi metodi: mancanza di ritiro della zampa posteriore dopo il pizzicamento delle dita dei piedi o mancanza di riflesso di ammiccamento. Quindi decapitare immediatamente con la ghigliottina. Rimuovere gli occhi con un paio di forbici dell'iride e metterli in un piatto di vetro contenente il 4% di paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4.
3. Utilizzando il microscopio da dissezione, rimuovere la cornea tagliando la parte anteriore del bulbo oculare. Rimuovere il cristallino e il vitreo dalla superficie retinica interna con una pinza.
4. Sbucciare la sclera con le due pinze fino a quando la retina non è isolata dall'oculare.
5. Tagliare immediatamente la retina in strisce spesse 100 - 200 μm con un rasoio e sottoporla a fissazione con spostamento del pH.
6. Fissare le strisce retina in paraformaldeide al 4% in 0,1 M PB a pH 6,0 per 20 - 30 minuti e poi in paraformaldeide al 4% più glutaraldeide allo 0,01% a pH 10,5 per 10 - 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
7. Dopo diversi lavaggi in PB con 0,15 mM di CaCl₂ (pH 7,4 a 4°C), crioproteggere le strisce retiniche con glicerolo (60 minuti ciascuno al 10%, 20%, 30%, quindi per una notte [O/N] al 30%) in 0,1 M di PB prima della sostituzione con congelamento.

2. Congelamento-sostituzione

NOTA: Questo metodo di congelamento-sostituzione è modificato da un protocollo pubblicato in precedenza. Inoltre, è fondamentale che gli strumenti siano molto freddi (indossare i guanti); In caso contrario, il tessuto potrebbe scongelarsi parzialmente se toccato con gli strumenti. Tutti questi passaggi vengono eseguiti all'interno della camera di sostituzione automatica del congelamento (AFS) e gli strumenti non possono mai muoversi oltre il bordo della camera. Allo stesso modo, è necessario un adeguato raffreddamento di tutte le sostanze chimiche utilizzate nell'AFS.

1. Congelare a immersione le strisce retiniche in propano liquido a -184°C in uno strumento di crioconservazione (CPC) al microscopio elettronico (EM). Usando un pennello sottile, posiziona i campioni su piccoli pezzi di nastro biadesivo attaccati ai tronchetti di metallo che vanno all'estremità delle aste di immersione (rimuovere il tampone extra usando il pennello).
2. Immergere le barre nel propano liquido e tenerle lì per circa 5 secondi, quindi trasferirle nello strumento automatico di sostituzione del congelamento (AFS) utilizzando una piccola camera di trasporto riempita con azoto liquido (LN₂ raffreddato contenitore di crio-trasferimento).
3. Dopo aver posizionato il campione congelato e gli strumenti (pinze e bisturi) nell'AFS, raffreddare gli strumenti nella camera per diversi minuti prima di toccare il tessuto, oppure raffreddarli posizionando le punte degli strumenti per alcuni secondi nella piccola camera di trasporto (riempita con azoto liquido (LN₂ raffreddato contenitore di crio-trasferimento)).
4. Una volta nell'AFS, Rimuovere il campione e il nastro adesivo dal tronchetto utilizzando un bisturi sottile. Inoltre, durante queste procedure, mantenere aperto il controllo del flusso di azoto gassoso, TF (TF è descritto come un "controllo del regolatore per il vaporizzatore LN₂").
5. Prima di posizionare il tessuto congelato nei supporti per inclusione piatta (, cioè , prima di impostare l'AFS), ritaglia un cerchio sottile da un foglio di plastica trasparente e posizionalo sul fondo del supporto per rivestire il fondo di ciascun pozzetto. Ciò consente una rimozione relativamente più semplice dei blocchi di campioni polimerizzati una volta terminati.
   NOTA: In precedenza, abbiamo utilizzato un metodo alternativo ai supporti piatti per l'inclusione e impiegando doppie Reichert+capsule di gelatina.
6. Utilizzare la seguente sequenza automatica nell'AFS (utilizzando la terminologia dello strumento): T1 = -90°C per 32 ore, S1 = aumento della temperatura di 4°C/ora (11,3 ore), T2 = -45°C per 50 ore, S2 = aumento della temperatura di 5°C/ora (9 ore), T3 = 0°C per 40 ore (totale = 142,3 ore). Potrebbero essere necessarie 2-4 ore per posizionare i campioni nell'AFS (a -90°C) prima di iniziare la sequenza temporizzata.
7. Immergere le sezioni congelate in acetato di uranile all'1,5% in metanolo a -90°C per >32 ore nell'AFS. Posizionare due pezzi di fazzoletti (in genere) in ciascuno dei sette pozzetti del supporto in alluminio per inclusione piatta (tre si inseriscono nell'AFS).
   1. Posizionare il tessuto+nastro nell'acetato di uranile/metanolo nei pozzetti e rimuovere il nastro in un secondo momento, appena prima di iniziare l'infiltrazione del mezzo di inclusione (come Lowicryl HM20), se è troppo difficile rimuovere il tessuto dal nastro.
8. Quindi aumentare gradualmente la temperatura a -45°C (+4°C all'ora; nella sequenza automatica).
9. Lavare i campioni tre volte in metanolo preraffreddato, utilizzando una pipetta di plastica a punta fine per rimuovere la vecchia soluzione da ciascun supporto di inclusione piatta, quindi utilizzando un'altra pipetta di plastica standard per aggiungere il metanolo fresco preraffreddato.
10. Quindi, utilizzando lo stesso metodo, infiltrare progressivamente i campioni con resine da inclusione a bassa temperatura come il mezzo da inclusione (HM20/metanolo a 1:1 e 2:1, ciascuno per 2 ore, seguito da resina pura per 2 ore, quindi cambiare le resine e mantenere O/N).
11. Cambiare nuovamente la resina il giorno successivo, regolando il livello della resina in modo che raggiunga appena il bordo superiore dei pozzetti.
12. Polimerizzare i campioni (da -45°C a 0°C in sequenza automatica; +5°C all'ora) con luce ultravioletta (UV) per 40 ore.
13. Quindi rimuovere i campioni dall'AFS. In genere, i blocchi campione mostrano ancora un po' di colore rosa. Posizionare i campioni vicino alla luce fluorescente nella cappa chimica, a RT O/N o più a lungo fino a quando non appaiono completamente limpidi.

3. Immunocitochimica EM Immunogold post-embedding

1. Tagliare sezioni da 1 μm con ultramicrotomo, colorare sezioni con blu di toluidina all'1% ed esaminarle per l'orientamento della sezione; Orientare il blocco di tessuto per ottenere il piano trasversale di sezionamento ottimale.
2. Taglia sezioni ultrasottili spesse 70 nm con l'ultramicrotomo e raccoglile su griglie a fessura in nichel rivestite in carbonio Formvar.
3. Lavare le griglie una volta in H₂O distillato, seguito da una soluzione salina tamponata Tris tre volte (TBS, tampone Tris 0,05 M, NaCl 0,7%, pH 7,6).
4. Incubare le griglie in gocce da 20 μl di albumina sierica bovina al 5% (BSA) in TBS per 30 minuti, e poi in gocce da 20 μl di una miscela contenente la subunità B della tossina anti-colera di capra (anti-CTB, 1:3.000) e un anticorpo contro una subunità del recettore N-metil-D-aspartato (NMDAR subunità A [GluN2A] 1:50, GluN2B 1:30) anti-coniglio, o un recettore eterotetrametico dell'acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolopropionico [AMPA], 1:30) in TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) con 2% BSA e 0,02 M NaN₃ O/N a RT.
5. Lavare le griglie su tre gocce separate (20 μl) di TBS (pH 7,6) per 10, 10 e 20 minuti, seguite da TBS (pH 8,2) per 5 minuti.
6. Incubare le griglie per 2 ore su gocce (20 μl) di una miscela contenente immunoglobulina G (IgG, 1:20) anti-coniglio d'asino accoppiata a particelle d'oro a 10 nm e IgG anti-capra d'asino (1:20) accoppiate a particelle d'oro a 18 nm in TBST (pH 8,2) con 2% BSA e 0,02 M NaN₃.
7. Lavare le griglie in gocce da 20 μl di TBS (pH 7,6) per 5, 5 e 10 minuti, quindi in acqua ultrapura e asciugarle.
8. Griglie di controcolorazione con il 5% di acetato di uranile e lo 0,3% di citrato di piombo in H₂O distillato per 8 e 5 minuti in condizioni di oscurità, rispettivamente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Paraformaldehyde	EMS	15710
Glutarldehyde	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glicerolo	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Diluizione 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	Diluizione 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	Diluizione 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Diluizione 1/100
Particelle d'oro anti-coniglio d'asino IgG-10 nm	EMS	25704	Diluizione 1/20
Particelle d'oro anti-topo d'asino IgG-10 nm	EMS	25814	Diluizione 1/20
Particelle d'oro IgG-5 nm anti-topo d'asino	EMS	25812	Diluizione 1/20
Particelle d'oro IgG-18 nm anti-capra d'asino	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Diluizione 1/20
Formvar-Griglie in nichel rivestite in carbonio.	EMS	FCF2010-Ni
Acetato di uranile	EMS	22400-1
Metanolo	EMS	67-56-1
Citrato di piombo	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultromicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
azoto liquido	Roberts Oxygen
Propano	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%<
List Biological Laboratories	703	Diluizione 1/4000

td style='height:15.75pt;'>Anti-CTB