Questo video dimostra il metodo per monitorare l'attivazione in tempo reale dei recettori degli odori nelle cellule di mammifero ricombinanti utilizzando la misurazione della luminescenza. Il legame con gli odori innesca l'attivazione delle proteine G e la produzione di cAMP, attivando le proteine glosensori che emettono luminescenza al momento del legame con il substrato, fornendo una misura quantitativa della risposta del recettore.
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Articolo metodologico
Monitoraggio in tempo reale dell'attivazione del recettore degli odori nelle cellule ricombinanti
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28 aprile 2025
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Hana3A Cells Culture
- Prepare M10 [Minimum Essential Medium (MEM) plus 10 % v/v fetale di siero bovino (FBS)) e M10PSF (M10 più 100 μg/mL di penicillina-streptomicina e 1,25 μg/mL di amfotericina B).
- Coltiva le cellule in 10 mL di M10PSF in un piatto di coltura cellulare da 100 mm in un incubatore impostato a 37 °C e 5% di anidride carbonica (CO2).
- Dividi le cellule ogni 2 giorni con un rapporto del 20%: quando si osserva una confluenza del 100% di cellule (circa 1,1 x 107 cellule) al microscopio a contrasto di fase, aspira il terreno e lava delicatamente le cellule con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aspira PBS e aggiungi 3 mL di acido tetraacetico tripsin-etilene diammina allo 0,05% (EDTA, 0,48 mM). Lasciare agire per circa 1 minuto, fino a quando le cellule non si dissociano dalla piastra.
- Aggiungi 5 mL di M10 per inattivare la tripsina e infine staccare le cellule ancora attaccate alla piastra pipettando su e giù.
- Trasferisci il volume (8 mL) in una provetta da 15 mL e centrifuga a 200 x g per 5 min. Aspira il surnatante e risospendi le cellule in 5 mL di M10PSF pipettando su e giù per rompere qualsiasi massa cellulare. Evitare di creare bolle nel tubo.
- Trasferisci 1 mL della soluzione di cellule risospese in un nuovo piatto di coltura cellulare da 100 mm e aggiungi 9 mL di M10PSF fresco. Incubare a 37 °C e 5% CO2.
2. Preparazione delle celle per la trasfezione
- Valuta la confluenza, o il numero di cellule, osservandole sotto un microscopio a contrasto di fase. Per una piastra è necessario almeno il 10% di confluenza (circa 1,1 x 106 celle).
- Aspira il terreno e lava delicatamente le cellule con 10 ml di PBS. Aspirare il PBS e aggiungere 3 ml di EDTA. Lasciare agire per circa 1 minuto a temperatura ambiente, fino a quando le cellule non si dissociano dalla piastra.
- Aggiungi 5 mL di M10 per inattivare la tripsina e infine staccare le cellule ancora attaccate alla piastra pipettando su e giù. Trasferire il volume (8 mL) in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min.
- Aspira il surnatante e risospendi le cellule in 5 mL di M10PSF pipettando su e giù per rompere qualsiasi massa cellulare. Evitare di creare bolle nel tubo.
- A seconda del numero di piastre da trasfettare, trasferisci una quantità appropriata di cellule in un serbatoio con il volume corrispondente corretto di M10PSF. Una piastra a 96 pozzetti deve essere placcata con 1/10 di una piastra confluente al 100% da 100 mm (circa 1,1 x 106 celle) diluita in M10PSF per raggiungere un volume totale di 6 mL. Per una piastra a 96 pozzetti che inizia con una piastra a confluenza al 100% da 100 mm, aggiungere 500 μl dai 5 mL di cellule risospese a 5,5 mL di M10PSF fresco. Mescolare le celle e M10PSF senza generare bolle d'aria.
- Pipetta 50 μL delle cellule sospese in ogni pozzetto della piastra da 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Incubare per una notte a 37 °C e 5 % di CO2.
3. Plasmid Transfection
- Osserva la piastra a 96 pozzetti sotto un microscopio a contrasto di fase per garantire una confluenza cellulare tra il 30% e il 50%.
- Prepara una prima miscela di trasfezione che contenga i plasmidi comuni all'intera piastra (una versione più corta della proteina di trasporto del recettore 1 (RTP1S), del recettore dell'odore (OR) e della proteina Glosensor; vedi Tabella dei Materiali) seguendo i volumi nella Tabella 1. Si noti che la quantità di OR con tag Rho deve essere divisa per il numero di OR se si verificano più OR.
NOTA: Consigliamo vivamente di aggiungere un controllo negativo vettoriale vuoto (qui Rho-pCI) e qualsiasi controllo positivo (OR noto per rispondere all'odorante testato) al piano dell'esperimento. - Prepara una seconda miscela di trasfezione contenente 500 μL di MEM e 20 μL di reagente Lipofectamine 2000 (valido per una piastra da 96 pozzetti, vedi Tabella dei Materiali). Aggiungere la seconda miscela alla prima e mescolare delicatamente pipettando su e giù e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 5 mL di M10 e mescolare delicatamente.
- Sostituisci l'M10PSF nella piastra a 96 pozzetti precedentemente placcata con 50 μL del mezzo di trasfezione finale. Incubare in un incubatore impostato a 37 °C e 5% di CO2 e sottovuoto la camera del luminometro per una notte.
4. Incubazione del substrato
- Osserva la piastra a 96 pozzetti al microscopio a contrasto di fase per garantire una confluenza cellulare tra il 60% e il 100%. Preparare una soluzione di simulazione della soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente 10 mM di acido idrossietilpiperazineetansolfonico (HEPES) e 5 mM di D-glucosio.
- Diluisci 75 μL della soluzione di reagente adenosina monofosfato ciclico (cAMP) (vedi Tabella dei Materiali) in 2,75 mL della soluzione di stimolazione. Rimuovere il mezzo di trasfezione dalla piastra a 96 pozzetti e lavare le cellule aggiungendo 50 μl di soluzione di stimolazione fresca a ciascun pozzetto.
- Rimuovi la soluzione di stimolazione e aggiungi 25 μL di soluzione reattiva di cAMP preparata nel passaggio 4.2 a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente in un ambiente buio e inodore (ad esempio, un cassetto vuoto pulito lontano da sostanze chimiche o qualsiasi fonte di odori) per 2 ore.
5. Stimolazione odorizzante
- Per prima cosa, equilibra la camera del luminometro con molecole odorose volatili. Diluire l'odorizzante alla concentrazione desiderata in 10 ml di olio minerale (Figura 1A). Prima della fine del tempo di incubazione del reagente cAMP, aggiungere 25 μl della soluzione odorizzante a una nuova piastra a 96 pozzetti (non quella contenente le cellule). Incubare questa piastra odorizzante a temperatura ambiente nella camera del luminometro per 5 minuti (Figura 1B) (qui non è richiesta la registrazione del luminometro).
- Imposta il luminometro per registrare la luminescenza con 0 s di ritardo durante 20 cicli di misurazione della lastra di 90 s con 0.7 s di intervallo tra i cicli.
- Subito prima di leggere la piastra, rimuovi la piastra odorante dalla camera. Aggiungere 25 μL di odorizzante tra i pozzetti della piastra a 96 pozzetti contenente le celle (non aggiungere l'odorizzante nei pozzetti contenenti le cellule) e avviare rapidamente la misurazione della luminescenza di tutti i pozzetti per 20 cicli entro 30 minuti (Figura 1C).
Tabella 1: Mix per la trasfezione. Quantità di plasmidi (proteina Glosensor, RTP1S e OR) da aggiungere alla MEM per trasfettare in una piastra a 96 pozzetti.
Per piastra a 96 pozzetti | |
MEM | 500 μL |
pGlosensor | 10 ng |
RTP1S | 5 ng |
OR | 75 ng |
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Risultati
Figura 1: Protocolli schematici per il monitoraggio in tempo reale dell'attivazione del recettore degli odori da parte del vapore L'odorante (violetta) è stato diluito all...
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Materiali
