Induzione della formazione di coaguli di sangue nel cervello del topo utilizzando un colorante fotosensibile

Abstract

Fonte: Talley Watts, L., et al. Fototrombosi del Rose Bengal mediante imaging ottico confocale in vivo: un modello di ictus a vaso singolo. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra una tecnica per indurre la formazione di coaguli di sangue nel cervello di un topo. Un topo anestetizzato con una finestra cranica e un cranio assottigliato va incontro a fototrombosi attraverso l'attivazione di un colorante fotosensibile utilizzando luce ad alta intensità. Questo processo genera specie reattive dell'ossigeno, che danneggiano le pareti dei vasi e innescano la formazione di coaguli, ostruendo infine il flusso sanguigno al cervello.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Anestetizzante per la preparazione corticale

1. Posizionare il topo in una camera di induzione con isofluorano al 2-3% mescolato con ossigeno per indurre l'anestesia. Osservare la frequenza respiratoria diminuire man mano che il topo viene indotto. Pizzicare la zampa del topo per determinare se il topo è pronto a spostarsi verso l'ogiva. Nota: Il livello di anestesia è un passaggio critico in qualsiasi preparazione in vivo e si dovrebbe fare attenzione a non indurre un livello che causerà ischemia globale.
2. Una volta che il topo è sufficientemente anestetizzato, trasferire l'animale sulla piattaforma chirurgica/di imaging e posizionare il naso del topo nel cono nasale e applicare l'1-1,2% di isofluorano per mantenere uno stato anestetizzato. Assicurarsi che il mouse sia appoggiato su un termoforo a temperatura controllata per mantenere la temperatura corporea (37°C +/- 0,5°C) durante le restanti procedure. Metti un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
3. Monitorare la fisiologia del topo utilizzando un sistema di pulsossimetria utilizzando la clip per la coda o il piede fornita con il sistema. Verificare che la frequenza respiratoria sia mantenuta tra i 50-65 respiri/min. Verificare che la frequenza cardiaca rimanga compresa tra 300 e 450 bpm e che la saturazione di ossigeno sia mantenuta tra il 97-98% per garantire la sopravvivenza a lungo termine dell'animale.
4. Quando il topo è adeguatamente anestetizzato, radere i peli sopra il cranio utilizzando un tagliacapelli elettrico, rimuovere i peli residui e pulire con betadina, seguito da un tampone di etanolo. Ripetere questa procedura fino a tre volte per garantire un ambiente chirurgico sterile.

2. Procedura chirurgica

1. Con il cuoio capelluto completamente pulito e rasato, praticare un'incisione di 5 mm nel cuoio capelluto del topo per rivelare le fessure craniche e localizzare la bregma.
2. Utilizzare un applicatore di cotone sterile per rimuovere l'eventuale fascia residua sovrastante il cranio.
3. Incollare un anello di acciaio inossidabile su misura (Figura 1) con adesivo di tessuto all'osso sovrastante la corteccia parietale utilizzando le coordinate stereotassiche di Bregma: da -1 a -3 mm e laterali: 2-4 mm. Nota: La colla in genere si solidifica entro 2 minuti dopo il posizionamento dell'anello sull'osso.
4. Fissare l'anello a un supporto stereotassico (Figura 2) per stabilizzare il mouse e prevenire il movimento durante l'imaging.
5. Sotto un microscopio da dissezione di grado chirurgico, praticare lentamente una sezione di 1-2 mm nel cranio utilizzando uno strumento simile a un dremel a velocità controllata (punta da trapano Meisinger da 3,9 mm) assicurandosi di mantenere l'area a livello durante la perforazione. A tale scopo, utilizzare uno schema a zig-zag. Per evitare l'accumulo di calore, impostare la velocità di perforazione su un valore basso e fare pause frequenti.
6. Quando il cranio cranico diventa lucido nell'aspetto, continua l'assottigliamento del cranio usando una lama di bisturi utilizzando lo stesso schema a zig-zag per mantenere il livello superficiale assottigliato per facilitare la rimozione regolare di strati sottili di cranio cranico. Usando la punta della lama del bisturi, fai piccoli movimenti lineari con una leggera pressione per rimuovere sottili strati di osso alla volta. Continuare fino a quando la vascolarizzazione è chiaramente visibile attraverso il microscopio da dissezione.
7. Se lo sperimentatore perfora o rompe il cranio durante il processo di assottigliamento, sopprimere l'animale a causa di un probabile danno alla corteccia sottostante.
   Nota: Il cranio del topo ha uno spessore di circa 300 μm ed è composto da due strati sottili di osso compatto (uno esterno e uno interno) e uno strato di osso spugnoso inserito tra i due strati di osso compatto. Lo strato esterno di osso compatto e la maggior parte dell'osso spugnoso vengono rimossi all'interno dell'area di perforazione di 5 mm, risultando in uno strato di circa 50 μm di osso compatto rimanente (vedi Figura 2B). La visualizzazione del sistema vascolare garantirà che il cranio finale intatto e assottigliato abbia uno spessore di circa 50 μm. Il cranio è quindi ancora presente quando viene assottigliato a questo spessore.

3. Configurazione del microscopio

1. Utilizzare un sistema di microscopio invertito (convenzionale, confocale o sistemi a due fotoni) che abbia un invertitore obiettivo. Nota: È anche possibile utilizzare un microscopio verticale standard. Il fattore limitante sarà lo spazio tra il palco e gli obiettivi. Per realizzare questa configurazione, potrebbero essere necessarie modifiche allo stadio.
2. Fissare la piattaforma chirurgica/di imaging a un tavolino su misura che si trova accanto alla base del microscopio. Nota: La piattaforma è realizzata utilizzando un martinetto da laboratorio per consentire il movimento verticale della piattaforma chirurgica/di imaging sotto l'obiettivo. Il martinetto da laboratorio è montato su una piastra fissata a quattro poli cilindrici. (Vedi Figura 2).
3. Posizionare l'invertitore dell'obiettivo contenente un obiettivo 20X sopra la finestra cranica. Utilizzare una fonte di luce esterna per trovare la finestra cranica guardando attraverso gli oculari del microscopio e posizionare l'obiettivo nell'area di imaging. Nota: L'area di imaging sarà indicata dalla presenza del sistema vascolare.
4. Per gli obiettivi a base d'acqua, utilizzare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl; 12 mM KH₂PO₄; 200 mM NaHCO₃; 30 mM di acido idrossietilpiperazina etano solfonico [HEPES]; e 100 mM di glucosio) come terreno a causa di potenziali perdite nella cavità cranica durante l'imaging (Figura 3).

4. Preparazione, somministrazione e induzione del colorante Rose Bengal dell'ictus

1. Preparare una soluzione fresca da 20 mg/ml di Rose Bengal in aCSF; Filtrare e sterilizzare prima della somministrazione. Non riutilizzare o conservare la Rose Bengal una volta che è stata mescolata. Crea una nuova soluzione per ogni esperimento.
2. Iniettare 0,1 ml di Rose Bengal nella vena caudale scansionando la finestra cranica con un laser a 561 nm per garantire un'adeguata iniezione della soluzione. Nota: la rosa bengala sarà visualizzata entro 5 secondi dall'iniezione nel sistema vascolare del cervello. L'intero recipiente dovrebbe essere riempito con Rose Bengal.
3. Dopo un'adeguata iniezione di colorante Rose Bengal, scegliere un vaso appropriato per la trombosi in base al diametro del vaso (40-80 μm) per garantire la riproducibilità di un particolare volume della lesione. Distingui tra arterie e vene osservando la direzione del flusso sanguigno: le arterie si sposteranno da vasi di diametro maggiore a vasi di diametro più piccolo, le vene si sposteranno da vasi di diametro più piccolo a vasi di diametro più grande. Ciò è facilmente realizzabile con la visualizzazione una volta iniettato il Rose Bengal.
4. Modificare l'impostazione del microscopio come segue:
   1. Aumentare il tempo di permanenza. Nota: Questo varia a seconda del sistema di microscopio utilizzato.
   2. Aumenta la potenza del laser al 100%.
   3. Raccogli immagini della sequenza temporale a 1 fotogramma/sec utilizzando la velocità di scansione massima.
5. Scansiona il topo fino a quando non si forma un coagulo stabile all'interno del vaso. Nota: questa operazione si ottiene in genere entro 5 minuti di scansione continua (vedere Figura 4).
6. Dopo l'induzione della formazione di coaguli utilizzando Rose Bengal, rimuovere il topo dall'area di imaging e riportarlo al microscopio da dissezione. Rimuovere con cautela l'anello in acciaio inossidabile dal cranio cranico. Esaminare la finestra cranica per eventuali sanguinamenti. Se si verifica un'emorragia, terminare l'esperimento.
7. Utilizzare la sutura monofilamento 6.0 per chiudere l'incisione sul cranio. Posizionare un unguento antibiotico lungo la linea di sutura per prevenire l'infezione. Iniettare Buprenex (0,05 mg/kg) per via sottocutanea ogni 12 ore per tre giorni per la gestione del dolore.
8. Rimettere il topo in una camera di recupero dopo la rimozione dall'anestetico fino a quando non è completamente sveglio e si muove liberamente.
9. Rimetti il topo in una gabbia pulita per ulteriori indagini in un secondo momento.

Risultati

Figura 1: Anello in acciaio inossidabile. Tre viste (vista dall'alto, laterale e dal basso) sono mostrate del supporto dell'anello in acciaio inossidabile che viene applicato al cranio del topo per fissarlo al supporto stereotassico.

Materiali