Modellazione della rigenerazione sensoriale degli assoni in un ratto utilizzando l'iniezione del ganglio della radice dorsale e la lesione da schiacciamento della radice dorsale

Abstract

Fonte: Cheah, M., et al. Iniezione del ganglio della radice dorsale e lesione da schiacciamento della radice dorsale come modello per la rigenerazione sensoriale degli assoni. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video mostra una procedura passo-passo per iniettare una sospensione virale nei gangli della radice dorsale (DRG) e indurre una lesione assonale controllata attraverso uno schiacciamento della radice dorsale in un ratto anestetizzato. Il protocollo prevede l'esposizione dei DRG, la somministrazione di un vettore virale che promuove la crescita per facilitare la rigenerazione assonale e la recisione delle connessioni assonali al midollo spinale per modellare la lesione e la rigenerazione dei nervi sensoriali.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Iniezione di DRG ed esecuzione di una lesione da schiacciamento della radice dorsale

NOTA: Questo è un intervento chirurgico estremamente delicato. Si consiglia di esercitarsi prima su alcuni animali morti per familiarizzare con l'anatomia prima di passare alla chirurgia degli animali vivi.

1. Localizzare i processi spinosi C2 e T2 prominenti sulla pelle. Praticare un'incisione cutanea tra i processi spinosi C2 e T2 con una lama di bisturi n. 10 (una volta aperta la pelle, una linea mediana bianca di tessuto fibroso dovrebbe essere visibile sul primo strato del muscolo; il primo strato del muscolo ha una consistenza "gelatinosa").
2. Praticare un'incisione di dimensioni simili sul primo strato di muscolo lungo la linea mediana bianca usando una lama di bisturi. Non andare oltre il prominente processo spinoso T2, poiché c'è un ramo arterioso principale dall'aorta discendente situato vicino a lì.
   NOTA: Da questo passaggio in poi può verificarsi un forte sanguinamento. Fermare sempre l'emorragia e rimuovere il sangue utilizzando cotton fioc sterilizzati o spugne chirurgiche riassorbibili per consentire una visualizzazione chiara in ogni momento. Procedere con la procedura "alla cieca" può causare danni indesiderati al midollo spinale, al DRG o alla radice dorsale, portando a effetti avversi imprevisti nell'animale in seguito.
3. Ritrarre il primo strato di muscolo utilizzando due divaricatori, uno posizionato rostralmente e uno caudalmente; Il secondo strato di muscolo, dall'aspetto striato, dovrebbe essere visibile.
4. Localizzare la linea mediana del secondo strato del muscolo (dove si possono osservare due muscoli longitudinali collegati da un tessuto sottile e membranoso). Sezionare il tessuto membranoso usando un paio di microforbici per separare i due muscoli longitudinali. Evitare l'uso di una lama di bisturi, se possibile, in quanto ciò potrebbe causare danni muscolari e sanguinamento non necessari.
5. Regolare i divaricatori di conseguenza per esporre il terzo strato di muscolo sottile che copre la colonna vertebrale. I processi spinosi possono essere avvertiti toccando leggermente con un paio di pinze sopra il terzo strato del muscolo.
6. Fai una piccola incisione sul terzo strato del muscolo usando le microforbici e raschia delicatamente il muscolo dall'osso usando una curette o un bisturi in modo laterale per esporre chiaramente le vertebre. Se necessario, tagliare parte del muscolo o del tendine per facilitare la laminectomia.
7. Per esporre i DRG C5 - C8 sinistri, eseguire un'emi-laminectomia sinistra sulle vertebre C4 - T1 rimuovendo accuratamente parte della lamina e del peduncolo utilizzando un paio di rongeurs sottili. Il DRG si trova vicino al forame trasverso delle vertebre.
   NOTA: Le vertebre C3 - C7 non hanno un processo spinoso prominente. Il DRG C5 si trova tra le vertebre C4 e C5, il DRG C6 si trova tra le vertebre C5 e C6 e così via, mentre il DRG C8 si trova tra le vertebre C7 e T1. Non c'è una vertebra C8, nonostante la presenza di un DRG C8 e di un segmento del midollo spinale C8.
8. Una volta che una quantità sufficiente di DRG è stata esposta per l'iniezione, preparare la siringa posizionando la siringa da microlitro riempita di virus dotata di un ago smussato calibro 33 su misura sul supporto della siringa stereotassica. Prima dell'iniezione, utilizzare un ago smussato calibro 30 per praticare una piccola apertura superficiale su ciascuno dei DRG mirati per facilitare l'inserimento dell'ago per iniezione.
9. Inserire l'ago calibro 33 al centro del DRG ruotando delicatamente le manopole per regolare le coordinate stereotassiche. Non inserire eccessivamente l'ago, poiché ciò potrebbe causare la fuoriuscita di liquido dal lato ventrale del DRG. In caso di perdite, regolare immediatamente la posizione dell'ago.
   NOTA: Le coordinate stereotassiche numeriche non vengono utilizzate; Tuttavia, è utile utilizzare il telaio per tenere l'ago per l'iniezione.
10. Iniettare 1 μL di virus in ciascun DRG a 0,2 μL/min utilizzando una pompa a siringa per infusione. Attendere altri tre minuti prima di estrarre l'ago. Durante l'iniezione, il DRG cambierà lentamente colore se la soluzione virale contiene un colorante colorato.
11. Per eseguire una lesione da schiacciamento della radice dorsale C5 - C8 concomitante, schiacciare ciascuna radice tre volte per 10 secondi ciascuna utilizzando un paio di pinze a punta fine (Bonn Micro), opponendosi completamente alle estremità della pinza; Una linea bianca nel tessuto dovrebbe apparire nel sito di schiacciamento. Non andare più in profondità del necessario con la pinza, poiché ciò potrebbe causare danni alla radice ventrale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fast Green FCF dye	Sigma-Aldrich	F7258	Per visualizzare una soluzione incolore. Concentrazione consigliata: 1%
Olsen-Hegar Needle Holder	Fine Science Tools	FST 12502-12
Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup	Fine Science Tools	FST 16121-14
Bonn Micro Forceps	Fine Science Tools	FST 11083-07	Per eseguire lesioni
Forbici per separare i tessuti	Fine Science Tools	FST 14072-10	<
Strumenti di Fine Science	FST 14058-11	<
Fine Science Tools	FST 11018-12
Goldstein Retractor	Fine Science Tools	FST 17003-03
Vannas Spring Scissors (dritto)	Fine Science Tools	FST 15018-10
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Ethicon	1972	Per il controllo
Microliter Syringe RN701 (10 μl)	Hamilton	80330
Ago rimovibile su misura (per iniezione DRG)	Hamilton	7803-05	33 gauge, 38 mm, point style 3
UltraMicroPump con controller SYS-Micro4	World Precision Instruments	UMP3-1

da schiacciamento della radice dorsaletd style='border-top-style:none;height:15.5pt;width:208pt;'>Fine Scissorstd style='border-top-style:none;height:15.5pt;width:208pt;'>Micro-Adson Forceps dell'emorragia