Valutazione dell'integrità della barriera emato-encefalica in un modello di ratto con lesione cerebrale indotta dal laser

Abstract

Fonte: Kuts, R. et al. Lesione cerebrale indotta dal laser nella corteccia motoria dei ratti. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra la valutazione dell'integrità della barriera emato-encefalica (BBB) a seguito di una lesione cerebrale indotta dal laser nei ratti. Un colorante tracciante viene iniettato nella vena della coda, permettendogli di circolare nel cervello e di fuoriuscire nel tessuto attraverso la BBB danneggiata. Il cervello viene quindi estratto e lavorato per rilasciare il colorante. L'intensità della fluorescenza del colorante viene misurata per quantificare l'entità del danno BBB indotto dal laser.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Procedura sperimentale per lesioni cerebrali indotte da laser

1. Assegna 20 ratti a un gruppo contrassegnato come gruppo laser e 20 ratti a un altro gruppo di controllo (azionato da sham).
2. Sottoporre i ratti del gruppo laser a irradiazione laser a 50J X 10 punti nel modo seguente:
   1. Anestetizzare il ratto con una miscela di isoflurano al 2% in ossigeno che consente la ventilazione spontanea. Verificare la profondità dell'anestetico sufficiente pizzicando la coda con una pinza per vedere l'assenza del riflesso di ritiro.
   2. Mantenere la temperatura corporea interna del ratto a 37 °C durante tutta la procedura sperimentale utilizzando un termoforo rettale a temperatura regolata.
   3. Rimuovere i peli locali con un rasoio e disinfettare con alcol al 70% e clorexidina gluconato allo 0,5%. Ripetere la fase di disinfezione altre due volte.
      NOTA: La dimensione dell'incisione chirurgica dovrebbe essere di circa 3 cm. Rimuovere i peli di almeno 2 cm intorno all'area dell'incisione.
   4. Posizionare il ratto su un supporto per la testa stereotassico in posizione prona e praticare un'incisione di 3 cm per riflettere lateralmente il cuoio capelluto e per esporre l'area tra Bregma e Lambda.
   5. Mantenere l'anestesia attraverso il cono del naso.
   6. Utilizzare un laser a granato di ittrio e alluminio drogato al neodimio (Nd-YAG) (lunghezza d'onda di picco 1064 nm) per somministrare 50J X 10 punti, con una durata dell'impulso di 1 s, all'area esposta del cranio sopra l'emisfero destro.
   7. Assicurarsi che la parte che genera il laser dell'apparecchio si trovi a una distanza di 2 mm dall'area esposta per produrre un raggio laser. 50J X 10 punti sono stati selezionati dopo un'attenta valutazione di diverse combinazioni energia/superficie. Questa combinazione è efficiente e non causa la distruzione ossea del cranio dopo la somministrazione per meno di un secondo.
      NOTA: 2 mm è la distanza tra il terminale del raggio laser (dal cavo ottico attraverso cui viene fatto passare) e l'osso del cranio. Nel caso in cui si utilizzi una lente di messa a fuoco, la distanza deve essere calcolata considerando l'angolo di inclinazione della lente per focalizzare il raggio nell'area di danno desiderata. Garantire un'adeguata sicurezza quando si utilizza un dispositivo laser, compresa un'adeguata formazione e protezione degli occhi.
   8. Rimuovere il ratto dal dispositivo e chiudere il cuoio capelluto con suture chirurgiche di seta 3-0.
   9. Interrompere l'anestesia e riportare il ratto nella sua gabbia per il recupero. Somministrare 0,1 ml di bupivacaina allo 0,25% localmente per ridurre il dolore postoperatorio subito dopo l'intervento chirurgico.
      NOTA: L'intera procedura dovrebbe durare meno di 5 minuti se eseguita correttamente.
3. Osservare il ratto per eventuali segni di angoscia durante il recupero post-anestesia. Prima di uscire dall'anestesia, somministrare 0,01 mg/kg di buprenorfina per via intramuscolare per l'analgesia postoperatoria e continuare con dosi ripetute ogni 12 ore per almeno 48 ore.
4. Sottoporre i ratti di controllo alle stesse condizioni senza sottoporli al laser.

2. Punteggio di gravità neurologica (NSS)

1. Valutare il punteggio di gravità neurologica 24 ore dopo la lesione cerebrale indotta dal laser utilizzando un punteggio di 43 punti. Testare gli animali per deficit neurologici, disturbi comportamentali, compiti di bilanciamento del raggio e riflessi, assegnando punteggi più alti per le disabilità più gravi.

3. Valutazione della lesione cerebrale

1. Determinazione dell'entità della rottura della barriera emato-encefalica (BBB)
   NOTA: Valutare la rottura della BBB 24 ore dopo la lesione cerebrale indotta dal laser come segue:
   1. Somministrare il 2% di blu di Evans miscelato con 4 ml/kg di soluzione salina per via endovenosa ai ratti tramite la vena caudale cannulata e lasciare che la soluzione circoli per 1 ora.
   2. Eutanasia dei ratti esponendoli al 20% di ossigeno e all'80% di CO₂ (tramite inspirazione) 24 ore dopo l'ultimo NSS.
   3. Raccogliere il colorante localizzato intravascolare come segue:
      1. Aprire il torace dei ratti con pincette chirurgiche e forbici chirurgiche.
      2. Perfondere gli animali con soluzione fisiologica raffreddata allo 0,9% attraverso il ventricolo sinistro utilizzando 110 mmHg fino ad ottenere un liquido di perfusione incolore dall'atrio destro.
   4. Raccogliere i cervelli e tagliarli rostro-caudalmente in fette di 2 mm.
   5. Separare le fette di cervello sinistro dalle porzioni destre per valutare separatamente gli emisferi danneggiati e non feriti.
   6. Pesare, omogeneizzare con mortaio e pestello, quindi incubare i tessuti cerebrali in acido tricloroacetico al 50% per 24 ore.
   7. Centrifugare le fette di cervello omogeneizzate a 10.000 × g per 20 min.
   8. Mescolare 1 mL di surnatante dal cervello centrifugato con 1,5 mL di etanolo al 96% a 1:3 e valutare la barriera emato-encefalica rottura utilizzando un rivelatore a fluorescenza a 620 nm di lunghezza d'onda di eccitazione (10 nm di larghezza di banda) e 680 nm di lunghezza d'onda di emissione (10 nm di larghezza di banda).
      NOTA: Entrambi i gruppi di ratti sono sottoposti allo stesso protocollo per determinare la degradazione della BBB.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
50% acido tricloroacetico	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Matrici cerebrali e tissutali	SIGMA - ALDRICH	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	1.84E+11
Centrifuga Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Bilance analitiche compatte	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Bilancia digitale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Forbici da dissezione	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Pipetta Eppendorf	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tubo	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Etanolo 96 %	ROMICAL		Liquido
Evans Blu 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Rivelatore di fluorescenza	Tecan, Männedorf Svizzera	modello Infinite 200 PRO lettore
Riscaldatore con termometro	Heatingpad-1	Modello: HEATINGPAD-1/2
Bracciale per infusione	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Microscopio Olympus BX 40	Olympus
piastre di Petri	SIGMA - ALDRICH	P5606
Lame per bisturi 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (granato di ittrio alluminio drogato al neodimio) Laser	Industries Ltd
Supporto per testa stereotassica	KOPF	900LS
Siringa sterile 2 ml	Braun	4606027V
Ago siringa 27 G	Braun	305620

Infiammabilemultimodale