Localizzazione a fluorescenza delle proteine a giunzione stretta e delle fibre di stress nelle cellule endoteliali

Abstract

Fonte: Alluri, H., et al. Deprivazione e riossigenazione di ossigeno-glucosio come modello di lesione da ischemia-riperfusione in vitro per lo studio della disfunzione della barriera emato-encefalica. J. Vis. Exp. (2015).

Il video dimostra la localizzazione fluorescente delle proteine a giunzione stretta e delle fibre di stress nelle cellule endoteliali microvascolari del cervello di ratto (RBMEC). Nel monostrato stressato, gli anticorpi marcati in fluorescenza vengono utilizzati per marcare le proteine della giunzione stretta, mentre la falloidina marcata con fluoroforo marcata marcano le fibre di stress. Le molecole marcate vengono quindi visualizzate attraverso la microscopia confocale.

Protocollo

1. Semina di cellule endoteliali

1. Ottenere colture primarie di RBMEC da ratti Sprague Dawley adulti (o ottenerle commercialmente).
2. Coltivare RBMEC in piastre di Petri rivestite di fibronectina da 100 cm (50 μg/ml) utilizzando il terreno di crescita delle cellule endoteliali del cervello di ratto. Cambiare il fluido ogni due giorni, fino a raggiungere la confluenza.
3. Al raggiungimento dell'80-90% di confluenza, lavare delicatamente le cellule in 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) agitandole. Le cellule vengono quindi staccate esponendole a 1 ml di soluzione calda di acido tripsin-etilendiamminotetraacetico (EDTA) allo 0,25%, bilanciata a 37 °C.
4. Incubare le cellule a 37 °C per 2-5 minuti fino a quando le cellule non si sono staccate e disperse.
   NOTA: Tocca il piatto di coltura per staccare le cellule. Visualizzare le cellule al microscopio per confermare il completo distacco delle cellule dalla superficie del piatto.
5. Aggiungere 5 ml di terreno completo alla capsula di Petri per neutralizzare la tripsina. Pipettare il terreno contenente le cellule staccate e raccoglierlo in una provetta da centrifuga da 15 ml.
6. Centrifugare il terreno contenente cellule endoteliali a 220 x g per 5 minuti.
7. Aspirare il surnatante e conservare le cellule contenenti pellet. Sospendi il pellet in 3-5 ml di terreno di coltura delle cellule endoteliali del cervello di ratto fresco mescolandolo delicatamente su e giù con la pipetta. Le cellule verranno quindi contate utilizzando un contatore automatico di cellule o un emocitometro.
8. Trasferire la sospensione cellulare in un sistema di vetrini a camera sterile prerivestiti con fibronectina (50 μg/ml), 0,7 cm²/pozzetto con una densità di semina compresa tra 10.000-15.000 cellule per pozzetto. Far crescere le cellule a 37 °C fino a raggiungere la confluenza
   NOTA: Per eseguire western blot o altri esperimenti, le cellule possono essere coltivate in piastre di coltura cellulare di 10 cm o in piastre speciali come richiesto dall'esperimento.

2. Deprivazione-riossigenazione di ossigeno e glucosio (OGD-R) In vitro Model

1. Utilizzare il sistema di coltura cellulare ipossia per studiare gli effetti di OGD-R sui RBMEC in (vedi Figura 1{{TAG_ 111}}). Impostare e calibrare il sistema di coltura cellulare per ipossia prima di iniziare l'esperimento, secondo le istruzioni del produttore.
2. Rimuovere i vetrini della camera confluente (passaggio 1.8) dall'incubatore a 37 °C. Sostituire l'intero terreno nel vetrino della camera con il Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) deossigenato, senza glucosio, e posto in camera di ipossia con il 95%, N₂ e CO₂ per 2 ore a 37 °C, per rappresentare la condizione OGD.
3. Spostare nuovamente le cellule nell'incubatore con il 95% di O₂, 5% CO₂ a 37 °C e incubare per un'altra 1 ora a 37 °C.
   {{TAG_ 154}}NOTA: Questo passaggio rappresenta una situazione di riossigenazione.
4. Utilizzare i vetrini della camera per la localizzazione dell'immunofluorescenza e la marcatura della falloidina della rodamina (vedere paragrafo 3).

3. Immunofluorescenza: localizzazione di zonula occludens-1 (ZO-1) e actina filamentosa ({{}}}{{}{}{}}{}}{}}{{}}{{}}{{}}{{}}({{}}{{}}{{}}{{}{}}{}}{{}}{}}{{}}{}}{F-actin) Etichettatura con falloidina rodamina

1. Esporre la camera scorre contenente monostrati RBMEC a 100 μl di opti-MEM/terreno di siero/pozzetto per 1 ora. Lavare i vetrini della camera 3 volte in 100 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,0-7,2).
2. Fissare le cellule utilizzando 100 μl di paraformaldeide al 4% in PBS (pH 7,0-7,2) per 15 minuti e lavare i vetrini della camera per altre 3 volte in PBS (pH 7,0-7,2).
3. Permeabilizzare le cellule utilizzando 100 μl di Triton X-100 allo 0,5% in PBS, (pH 7,0-7,2) per altri 15 minuti. Bloccare con 100 μl di albumina sierica bovina (BSA) al 2% in PBS per un'ora. Dopo questo passaggio, colorare/etichettare le celle per ZO-1 o f-actina.
   1. Per la colorazione in immunofluorescenza, incubare le cellule con un anticorpo primario anti-coniglio contro ZO-1 in 1:150, preparato in BSA-PBS al 2% per una notte (O/N) a 4 °C. Lavare le cellule 3 volte in PBS (pH 7,0-7,2). Incubare con 100 μl di anticorpo secondario anti-coniglio marcato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) per 1 ora a temperatura ambiente (RT).
   2. Per la marcatura della falloidina rodamina, dopo il blocco, esporre le cellule a 100 μl di falloidina di rodamina in diluizione 1:50, preparata in BSA-PBS al 2%, per 20 min.
   3. Lavare le cellule dalla colorazione in immunofluorescenza e dalla marcatura della falloidina della rodamina in PBS, (pH 7,0-7,2). Montare le camere utilizzando un terreno di montaggio contenente un reagente anti-sbiadimento con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
4. Visualizzando le cellule utilizzando una lente a immersione in acqua 60X, le cellule vengono scansionate su un unico piano ottico al microscopio confocale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 pozzetti sterili, vetrini	Thermo scientific	177402
Secondario anti-coniglio con tag FITC anticorpo	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	È possibile utilizzare qualsiasi altro PBS disponibile