Un modello di lesione minima del midollo spinale per studiare l'attivazione e la migrazione delle cellule staminali neurali

Abstract

Fonte: Lakshman, N., et al. Un test della neurosfera per valutare l'attivazione endogena delle cellule staminali neurali in un modello murino di lesione minima del midollo spinale. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra l'attivazione e la migrazione delle cellule staminali neurali (NSC) in un modello di lesione del midollo spinale di topo. Per esporre il midollo spinale, una vertebra dalla regione toracica della colonna vertebrale viene rimossa da un topo anestetizzato. Una lesione superficiale viene quindi creata nella sostanza bianca del midollo spinale utilizzando un ago piegato, che preserva il canale centrale. Dopo la lesione, le NSC che circondano il canale vengono attivate e migrano verso il sito della lesione per aiutare la riparazione dei tessuti.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Chirurgia minima per lesioni del midollo spinale

NOTA: Prima dell'intervento chirurgico, assicurarsi che tutti gli strumenti e i materiali chirurgici siano sterilizzati con metodi appropriati (Figura 1A).

1. Costruisci un arco di supporto toracico arrotolando 4-5 quadrati di garza e fissandoli insieme al centro per ottenere un rotolo fisso di garza.
2. Posizionare il topo nella camera di induzione e iniziare l'anestesia con isoflurano al 5%. Confermare l'assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi prima di procedere, così come durante tutta la procedura. Poiché l'intervento chirurgico può richiedere fino a 30 minuti per essere completato, ottimizzare per l'esposizione minima all'isoflurano (5 minuti al 5% e il tempo rimanente al 2-3%).
3. Trasferire il mouse su un cono nasale collegato alla macchina anestetica alla dose di mantenimento dell'isoflurano al 2-3%. Utilizzare un tagliacapelli per rimuovere il pelo dal dorso dell'animale da metà schiena fino al collo/orecchie per esporre un'ampia area rettangolare di pelle per la chirurgia.
4. Trasferisci il mouse su uno strumento stereotassico posizionando il naso nel cono del naso attaccato e stabilizzando il cranio con barre auricolari. Mantenere l'isoflurano al 5% durante il posizionamento delle barre auricolari e abbassare la schiena al 2-3% una volta che il mouse è fissato nel dispositivo stereotassico.
5. Somministrare farmaci analgesici preoperatori per via intraperitoneale - Meloxicam (2,0 mg/kg). Applicare generosamente la lubrificazione oculare sugli occhi aperti del topo per prevenire l'essiccazione corneale durante l'anestesia.
6. Posiziona l'arco di supporto toracico sotto l'addome del topo mentre raddrizzi il corpo e la colonna vertebrale del topo tirando leggermente la base della coda. Usa il nastro adesivo da laboratorio per fissare la coda e tutti gli arti estesi in una posizione a stella. Una volta fissato, spingere l'arco di supporto toracico rostralmente, dall'addome del topo verso la parte superiore del torace, al fine di sostenere la colonna vertebrale toracica (Figura 1B).
7. Preparare un campo chirurgico sterile disinfettando l'area cutanea tagliata dal pelo preparata al passaggio 1.3 con etanolo al 70%, seguito da iodio povidone. Ripeti due volte. Applicare un telo chirurgico sterile per mantenere un ampio campo sterile.
8. Usando una lama di bisturi #10, praticare un'incisione verticale parallela all'asse longitudinale dell'animale dal punto medio di entrambe le scapole alla curvatura della colonna vertebrale toracica. Ritrarre la pelle per esporre i tessuti molli e il contorno della colonna vertebrale (Figura 1C).
9. Identificare il bordo inferiore del cuscinetto adiposo soprascapolare (questo delimita il livello vertebrale T4/5). Con la stessa lama #10, con attenzione ma con forza, taglia lungo entrambi i lati dell'osso vertebrale T5-T8/9 per staccare i tendini del muscolo posteriore dalla colonna.
10. Inserire i denti dei divaricatori nei siti di incisione su entrambi i lati della colonna vertebrale. Regolare l'esposizione espandendo i divaricatori per sollevare sufficientemente la colonna vertebrale senza mettere troppo a dura prova gli strati muscolari retratti (Figura 1D).
11. Sotto il microscopio operatorio, pulire accuratamente il muscolo residuo e gli altri tessuti molli sovrastanti la colonna vertebrale per esporre l'osso vertebrale (Figura 1E). Identificare le vertebre che verranno rimosse afferrando il processo spinoso delle vertebre con una pinza dentata e muovendolo leggermente su e giù.
    NOTA: Questo dovrebbe consentire l'identificazione delle articolazioni intervertebrali ed esporre le piccole aperture (forami intervertebrali) sotto le vertebre di interesse.
12. Inserire una testa delle forbici smussate curve su entrambi i lati del forame intervertebrale esposto, caudale alla lamina vertebrale da asportare, e tagliare bilateralmente le articolazioni intervertebrali di collegamento.
13. Sollevare la lamina verso l'alto e tagliare l'attacco superiore della lamina per isolare e rimuovere l'osso.
    NOTA: Questo esporrà il sacco durale intatto contenente il midollo spinale (Figura 1F). Potrebbe esserci un sanguinamento eccessivo che può essere controllato posizionando una garza pretagliata di 1 cm x 1 cm sulle aree interessate e/o lavando con soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS).
14. Con la vena della linea mediana dorsale che funge da punto di riferimento, inserire un'asta piegata a 45° della punta di un ago da 30 G (con lo smusso dell'ago rivolto verso l'alto) nella superficie dorsolaterale del midollo spinale (a circa 1 mm di profondità) a circa 0,5 mm lateralmente a entrambi i lati della linea mediana.
15. Spostare l'ago di ~2 mm dalla caudale al rostrale (parallelamente alla linea mediana) in modo che l'intera lunghezza dello smusso dell'ago sia inserita nel cordoncino. Rimuovere l'ago ripercorrendo il percorso di ingresso (Figura 1G).
    NOTA: Non ci dovrebbe essere sanguinamento, ma in questa fase potrebbe essere visibile gonfiore del tessuto spinale.
16. Per chiudere la ferita, rimuovere il divaricatore e suturare i muscoli della schiena su entrambi i lati della lesione insieme nella linea mediana utilizzando una sutura assorbibile 6-0. Utilizzare una sutura di seta sterile 4-0 per chiudere successivamente la pelle sovrastante.

Risultati

Figura 1: Procedura chirurgica. (A) Il layout di tutto ciò che è richiesto, numerato per riferimento. (B) Un'immagine del topo in un dispositivo stereotassico con il corpo raddrizzato, la colonna vertebrale e gli arti divaricati e fissati con nastro adesivo insieme all'arco di supporto toracico posto sotto. (C) Un'immagine del topo con un'incisione cu...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agricola Retractor	Fine Science Tools	17005-04
Moria Forbici a molla Vannas-Wolff (curve)	Strumenti per la scienza	15370-50<
Pinza Graefe (Dritta, 1x2 denti)	Strumenti per la scienza fine	11053-10
Pinze Graefe extra fini (curve, seghettate)	Strumenti di Fine Science	11152-10	O qualsiasi altra pinza per sutura
Hartman Hemostats (Straight)	Fine Science Tools	13002-10	O qualsiasi altro appropriato per la sutura
Manico bisturi #3	Strumenti di Fine Science	10003-12	O qualsiasi altro appropriato
Tagliacapelli	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	o qualsiasi altro appropriato
Strumento stereotassico	Stoeling	51500	o qualsiasi altro appropriato
Meloxicam			o qualsiasi altro appropriato sanzionato dalla struttura
Lacrime Naturale P.M.	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	o qualsiasi altro appropriato
Isoflurane	Baxter International Inc	DIN 02225875	o qualsiasi altro appropriato per l'anestesia
Q-tips Cottom Swabs	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS	<
Fisher Scientific	13-761-52
30G Aghi	Becton Dickinson	305106	Per lesioni
25G Aghi	Becton Dickinson	305122	Per iniezioni
1mL Siringhe	Becton Dickinson	3090659	per iniezioni
3mL Siringhe	Becton Dickinson	309657	per iniezioni di fluidi
4-0 Suture	uoftmedstore.com	2297-VS881	per suturing
6-0 Suture<	VS889	per suturing
Strumenti di dissezione standard	Strumenti di Fine Science
Microscopio di dissezione	Zeiss	Stemi 2000

finetd style='width:292pt;'>Personalizza quando ordini per ottenere punte smussatedi cura degli animalitd style='height:14.5pt;width:237pt;'>Cotton Garze di farmaci di farmaci cutaneotd style='width:149pt;'>uoftmedstore.com muscolare