Questo video mostra la preparazione di tessuto cerebrale di primati non umani fissato con aldeide utilizzando l'immunoistochimica pre-incorporata per la microscopia elettronica. Delinea i passaggi per l'immunomarcatura di una specifica proteina neuronale, seguita da una reazione di perossidasi che produce un precipitato colorato, consentendo la visualizzazione della proteina bersaglio in microscopia elettronica.
Articolo metodologico
Esecuzione di immunoistochimica su un tessuto cerebrale di primati non umani
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28 aprile 2025
In questo articolo
Abstract
Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Immunoistochimica pre-incorporazione (Figura 1C)
- Preparare una soluzione madre da 4 L di soluzione salina tamponata con Tris (TBS, 50 mM, pH 7,6) come segue.
- Misurare 2 litri di acqua distillata in un becher da 4 litri, aggiungere 24,23 g di triidrossimetilamminometano (THAM; C4H11NO3), e mescolare per sciogliere.
- Regolare il pH a 7,6 con circa 148 mL di HCl 1 N. L'acido deve essere aggiunto con cautela per evitare di raggiungere un pH inferiore a 7,6. Il volume totale dovrebbe essere di 4 L.
ATTENZIONE: HCl è altamente corrosivo. Indossare i DPI adeguati.
- Selezionare le sezioni contenenti la regione di interesse da elaborare per l'immunoistochimica EM.
- Lavare le sezioni flottanti 3 volte in PBS (0,1 M, pH 7,4) per 5 minuti a RT per risciacquare la soluzione antigelo.
- Preparare una soluzione allo 0,5% di NaBH4 diluita in PBS.
- Pesare 0,05 g di NaBH4 e diluirlo in 10 mL di PBS. Non coprire. Preparare questa soluzione appena prima dell'uso.
- Incubare le sezioni nella soluzione di NaBH4 appena preparata per 30 minuti a RT. Agitare delicatamente. Non coprire.
- Lavare 3 volte in PBS per 10 minuti a RT, oscillando energicamente fino a quando non rimane più gas di reazione.
- Preparare una soluzione bloccante per EM con il 2% di siero normale appropriato e lo 0,5% di gelatina di pesce fredda diluita in PBS.
NOTA: La quantità dovrebbe essere calcolata in modo da averne abbastanza per i successivi tre passaggi. Utilizzare un siero proveniente dalla stessa specie animale che ospita l'anticorpo secondario. Evitare l'uso di metodi di recupero dell'antigene o l'aggiunta di piccole quantità di tritone (per aumentare la penetrazione degli anticorpi), poiché questi metodi compromettono significativamente la qualità del tessuto. - Incubare delicatamente le sezioni nella soluzione bloccante per 1 ora a RT. Rock.
- Preparare la soluzione di anticorpi primari diluita nella soluzione bloccante.
NOTA: La concentrazione dell'anticorpo primario è solitamente la stessa di quella dell'immunoistochimica LM, ma considera di condurre test con diverse concentrazioni di anticorpi in anticipo, poiché alcuni anticorpi primari potrebbero non funzionare con l'acroleina. In tal caso, è possibile utilizzare una miscela di glutaraldeide (0,1 - 2%) e PFA al 4% per la perfusione transcardiaca e ottenere risultati simili. Ottimizza anche il tempo di incubazione e la temperatura. - Incubare le sezioni in soluzione di anticorpi primari per una notte a RT con un leggero dondolio. Utilizzare un tempo e una temperatura di incubazione precedentemente testati.
- Lavare le sezioni 3 volte in PBS per 5 minuti a RT con un leggero dondolo.
- Preparare una soluzione 1:1.000 di anticorpo secondario biotinilato diluito nella soluzione bloccante.
NOTA: L'anticorpo secondario deve essere sollevato contro la specie ospite utilizzata per generare l'anticorpo primario. - Incubare le sezioni in una soluzione di anticorpi secondari per 1,5 ore a RT. Rock delicatamente.
- Preparare una soluzione di avidina-biotina-perossidasi (ABC) almeno 60 minuti prima della fine dell'incubazione degli anticorpi secondari.
- Utilizzare una pipetta calibrata per misurare 8,80 μL/mL di soluzioni A e B e diluirle in PBS.
- Agitare delicatamente per almeno 60 minuti a RT per consentire il completo legame tra le molecole di avidina e biotina.
- Dopo l'incubazione nella soluzione di anticorpi secondari, lavare 3 volte in PBS per 10 minuti a RT.
- Incubare le sezioni nella soluzione ABC per 1 ora a RT. Agitare delicatamente.
- Lavare una volta in PBS e due volte in TBS per 10 minuti a RT con un leggero dondolo.
- Preparare una soluzione fresca di 3,3'-diaminobenzidina allo 0,05% (DAB) con 0,005% di H2O2 diluito in TBS.
- Pesare 12,5 mg di DAB e diluirlo in 25 mL di TBS freddo. Proteggere dalla luce.
ATTENZIONE: La polvere DAB è altamente volatile e dannosa se inalata. È cancerogeno e teratogeno. Pertanto, le donne incinte o che allattano non dovrebbero manipolare questo prodotto, anche se diluito. Utilizzare una maschera N95 durante la manipolazione e indossare DPI. - Filtrare la soluzione e aggiungere 4,5 μL di H2O2 appena prima dell'uso.
- Pesare 12,5 mg di DAB e diluirlo in 25 mL di TBS freddo. Proteggere dalla luce.
- Incubare le sezioni nella soluzione DAB per 3-7 minuti a RT. Scuotere delicatamente.
NOTA: Il precipitato marrone non dovrebbe essere troppo scuro per evitare un alto livello di colorazione di fondo. Il tempo di incubazione dovrebbe essere ottimizzato di conseguenza. - Arrestare la reazione lavando rapidamente due volte in TBS freddo, poi due volte per 10 minuti in TBS freddo a RT, seguite da due volte per 10 minuti in PB, con un leggero dondolio.
NOTA: L'uso del PB (e non del PBS) è fondamentale per eliminare qualsiasi traccia di NaCl, poiché reagirebbe con l'osmio e formerebbe cristalli.
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Risultati
Figura 1: Schemi dei passaggi essenziali del protocollo. Il cervello di scimmia (A) è tagliato in sezioni seriali con un vibratomo di raffreddamento (B). Viene q...
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