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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
- Tissue Staining
In una scatola di colorazione a tenuta di luce, crea una "camera di umidità" con tessuti privi di lanugine imbevuti di acqua deionizzata.- Asciuga i bordi del vetrino con un fazzoletto privo di lanugine, usa un mini pap pen per creare un bordo idrorepellente sul bordo stesso del vetrino, lontano dalle sezioni di tessuto. Questo bordo dovrebbe garantire un ampio spazio tra il menisco del liquido e il bordo del tessuto in modo che la tensione superficiale non influisca sulla colorazione.
NOTA: Il bordo repellente per la penna può essere applicato prima della versione 1.1.3 se gli anticorpi di interesse non richiedono il recupero dell'antigene a microonde. Se la pap pen è stata applicata prima del lavaggio in PBS, in questa fase è necessario verificare l'integrità del bordo idrorepellente. Usa una mini-pap pen per riempire eventuali spazi vuoti nel bordo. - Con i vetrini disposti orizzontalmente, blocca il legame dell'antigene non specifico incubando nel siero al 4% v/v in PBS (soluzione a blocchi). Pipettare 300 μl di soluzione a blocchi per vetrino per 1 ora a temperatura ambiente. Assicurarsi che la soluzione di blocco si estenda fino alla pap pen sul bordo del vetrino e copra completamente il tessuto per evitare macchie irregolari causate dalla tensione superficiale vicino al tessuto.
- Usa siero della stessa specie in cui è prodotto l'anticorpo secondario. Nota: In questa procedura, gli anticorpi secondari vengono prodotti nell'asino e quindi viene utilizzato il siero d'asino. Se vengono utilizzati anticorpi secondari di due o più specie diverse, includere il siero di ciascuna specie.
- Pipetta l'anticorpo primario sui vetrini. Nota: le concentrazioni di anticorpi per questa colorazione sono state ottimizzate a 1:5.000 e 1:500 rispettivamente per Iba1 e Pan-neuronale. È stato riscontrato che queste concentrazioni mostrano una colorazione significativa senza colorazione di fondo.
- Diluisci la soluzione in blocchi all'1% di siero in PBS e aggiungi anticorpi primari. Pipettare 300 μl di soluzione di anticorpi primari in siero all'1% per vetrino. Ancora una volta, assicurati che il fluido sia sul bordo della pap pen. Incubare per una notte a 4 °C.
- Includi tre vetrini di controllo: uno che non contiene né Iba1 né anticorpi Pan-neuronali, uno con Iba1 senza anticorpi Pan-neuronali e uno con anticorpo Pan-neuronale senza Iba1. Colorare questi vetrini nella stessa corsa con le stesse soluzioni, tuttavia omettere gli anticorpi primari per testare il legame non specifico degli anticorpi secondari.
- La mattina seguente, lava le diapositive tre volte in PBS per 5 minuti ciascuna, cambiando la soluzione tra un lavaggio e l'altro.
- Gli anticorpi fluorescenti sono sensibili alla luce, quindi, da questo passo in poi, riduci al minimo l'esposizione alla luce assicurandoti che i contenitori di lavaggio siano avvolti in un foglio di alluminio e che le scatole di ibridazione siano nere o incubate al buio. Pipettare gli anticorpi secondari appropriati su tutti i vetrini e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente a una concentrazione di 1:250 in soluzione a blocchi (vedere la fase 1.2.3) in una "camera di umidità" a tenuta di luce (vedere la fase 1.2.1).
- Usa anticorpi secondari di diverse lunghezze d'onda. Qui, per l'anticorpo primario coniglio anti-Iba1, utilizzare l'anti-coniglio asino 594 come anticorpo secondario appropriato. Per l'anticorpo primario di topo anti-Pan-neuronale, utilizzare l'anticorpo anti-topo d'asino 488 come anticorpo secondario appropriato. In alternativa, utilizzare l'anti-coniglio 488 e l'anti-topo 594.
- Lava le diapositive tre volte in PBS per 5 minuti ciascuna.
- Opzionale: esegui la colorazione nucleare.
- Place in Hoechst (o altra colorazione nucleare) a una concentrazione di 0.03 μg/ml in doppia distillazione H2O per esattamente 60 secondi.
- Lava le diapositive tre volte in PBS per 5 minuti ciascuna.
- Wash in ddH2O.
- Vetrino coprioggetti<ol style='tipo-stile-lista:decimale;'>
- Vetrini coprioggetti con un mezzo di montaggio acquoso, come Fluoromount-G o ProlongGold. Fare attenzione a rimuovere tutte le bolle utilizzando un applicatore con punta di cotone.
Nota: Potrebbero essere utilizzati altri agenti di montaggio, tuttavia alcuni hanno notato un elevato sanguinamento tra i coloranti entro pochi giorni dal passaggio al vetrino. - Usa lo smalto trasparente per sigillare i bordi, evitando che le sezioni si secchino a causa dell'evaporazione. Lasciare asciugare lo smalto in un contenitore a tenuta di luce mentre i vetrini rimangono piatti e a temperatura ambiente, quindi conservare in un contenitore a tenuta di luce avvolto in un foglio a 4 °C.