Colorazione immunoistochimica di biomarcatori in sezioni di neurosfera tumorale cerebrale

Abstract

Fonte: Núñez, F. J., et al. Valutazione dei biomarcatori nel glioma mediante immunoistochimica su colture di neurosfere di glioma 3D incluse in paraffina. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra una tecnica immunoistochimica per l'etichettatura di biomarcatori tumorali nelle neurosfere tumorali cerebrali incluse in paraffina. Le sezioni della neurosfera subiscono la rimozione e la reidratazione della paraffina, seguite da un trattamento per esporre i siti dei biomarcatori. Gli anticorpi primari e secondari vengono quindi applicati per marcare questi biomarcatori. Gli anticorpi secondari sono legati da enzimi perossidasi coniugati con avidina, che ossidano i substrati cromogenici per indicare le posizioni dei biomarcatori. Infine, la controcolorazione nucleare e la preparazione dei vetrini sono completate per l'analisi microscopica.

Protocollo

1. Immunoistochimica (IHC) di neurosfere (NS) incluse in paraffina

1. Sciogliere la paraffina ponendo i vetrini in una rastrelliera metallica e incubandoli a 60 °C per 20 minuti.
2. Deparaffinare i vetrini mediante incubazione in un treno di reidratazione a temperatura ambiente (RT): 3x xilene per 5 minuti, 100% 2x etanolo per 2 minuti, 95% 2x etanolo per 2 minuti, 70% 1x etanolo per 2 minuti e 1x acqua deionizzata per 2 minuti. A questo punto, conservare i vetrini in acqua di rubinetto fino al recupero dell'antigene, poiché l'essiccazione causerà il legame di anticorpi non specifici.
3. Incubare i vetrini in tampone citrato (10 mM di acido citrico, detergente non ionico allo 0,05%, pH 6) a 125 °C per 30 s e a 90 °C per 10 s. Lasciarli raffreddare, quindi sciacquare i vetrini 5 volte con acqua distillata.
4. Incubare i vetrini a RT allo 0,3% H₂O₂ per 30 min.
5. Lavare i vetrini 3 volte in tampone di lavaggio (0,025% di detersivo in soluzione salina tamponata con Tris [TBS]) per 5 minuti agitando delicatamente.
6. Incubare i vetrini a RT con una soluzione bloccante (10% siero di cavallo, 0,1% albumina sierica bovina [BSA] in TBS) per 30 min.
7. Incubare i vetrini per una notte a 4 °C in una camera umidificata con anticorpo primario preparato in soluzione di diluizione (0,1% BSA in TBS). Lavare i vetrini 3 volte nel tampone di lavaggio per 5 minuti agitando delicatamente.
8. Incubare i vetrini a RT per 1 ora con un anticorpo secondario biotinilato preparato in soluzione di diluizione. Lavare i vetrini 3 volte nel tampone di lavaggio per 5 minuti agitando delicatamente.
9. Incubare i vetrini a RT al buio per 30 minuti con il complesso avidina-biotinilato di perossidasi di rafano. Lavare i vetrini 3 volte nel tampone di lavaggio per 5 minuti agitando delicatamente.
10. Incubare i vetrini con 3,3′-Diaminobenzidina (DAB)-H₂O₂ marche di substrato qui per 2-5 minuti a RT.
11. Risciacquare 3 volte con acqua di rubinetto. Immergere (1-2 s) i vetrini in una soluzione di ematossilina per contrastarli, quindi sciacquarli accuratamente in acqua di rubinetto fino a quando non saranno limpidi.
12. Disidratare i vetrini come segue: incubare in acqua distillata per 2 minuti, immergere 3 volte in etanolo all'80%, incubare in etanolo al 95% 2 volte per 2 minuti ciascuna, incubare in etanolo al 100% 2 volte per 2 minuti ciascuno e infine in xilene 3 volte per 3 minuti ciascuno.
13. Applicare il vetrino coprioggetto con un mezzo di montaggio a base di xilene e lasciarlo asciugare su una superficie piana a RT fino a quando non sono pronti per l'imaging.

NOTA: Se si esegue la colorazione DAB, i vetrini possono essere conservati presso RT. Tuttavia, se viene eseguita la colorazione in immunofluorescenza, i vetrini devono essere conservati al buio a -20 °C per ridurre il fotosbiancamento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-ATRX policlonale di coniglio,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1::Diluizione 250
Coniglio policlonale anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, diluizione 1:1000
Coniglio policlonale anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, diluizione 1:500
policlonale di capra anti-coniglio coniugato con biotina	Dako	E0432	IHC, 1::}}{{}}IHC, 1:1000 diluizione
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT{{TAG_ 61}}	Biocare medical	BDB2004 L/prezzo fino al 18/12