Analisi ultrastrutturale di una sezione cerebrale di topo mediante microscopia elettronica a trasmissione

Abstract

Fonte: Lutz, D., et.al. Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturale dopo la trasduzione in utero del cervello di topo in via di sviluppo e del midollo spinale. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra la preparazione e l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) di una sezione cerebrale di un cucciolo di topo. Il protocollo inizia con il tessuto fissato con tetrossido di osmio incorporato nella resina, seguito da un taglio preciso per isolare la regione di interesse e dall'ultramicrotomia per produrre sezioni semisottili e ultrasottili, che vengono visualizzate utilizzando rispettivamente la microscopia ottica e la TEM.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Selezione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturale per l'analisi quantitativa

1. Mappatura dell'area di interesse
   1. Scegli un'area di interesse (ad esempio, ippocampo o cervelletto) e localizza l'area nella sezione atlante scegliendo l'immagine dall'atlante che contiene quest'area.
   2. Disegnare i bordi dell'area di interesse sull'immagine della sezione e trovare/sovrapporre questi bordi della regione al campione di resina.
   3. Segnare a graffio i bordi dell'area di interesse (ad esempio, ippocampo o cervelletto) sul campione di resina, utilizzando un ago sottile (26 G, 1 pollice).
   4. Riscaldare il campione di resina a 85 °C in un forno per ammorbidire la resina per la rifilatura o, in alternativa, utilizzare un dispositivo di rifilatura, una lama sottile o carta vetrata.
   5. Eliminare l'area di interesse dal campione di resina con una lama di rasoio. Montare il campione su barre di supporto di vetro acrilico del calibro richiesto (ad es. con un diametro di 8 mm e una lunghezza di 1 cm) con colla. Tagliare il campione montato per il sezionamento semisottile e ultrasottile.
   6. Preparare sezioni semisottili (0,75 μm) e ultrasottili (70 nm) dell'area rifilata utilizzando un ultramicrotomo: impostarlo a 1,5 mm/s per uno spessore di 0,75 μm e a 0,7 mm/s per uno spessore di 70 nm.
   7. Raccogliere le sezioni semisottili su supporti di vetro e colorare le sezioni con l'1% di blu di toluidina in PBS (per 4 minuti).
   8. Lavare più volte le sezioni in acqua deionizzata. Esaminare le sezioni colorate al microscopio ottico utilizzando obiettivi 4x (NA di 0,1 ∞/-), 10x (NA di 0,22 ∞/0,17), 40x (NA di 0,65 ∞/0,17) e 100x (NA di 1,25 ∞/0,17).
   9. Raccogli sezioni ultrasottili su griglie di nichel. Sottoporre le griglie a TEM a 180 kV e a 3.200x, 6.000x e/o 8.000x di ingrandimento.
2. Analisi TEM
   1. Scegli i parametri ultrastrutturali di interesse per l'analisi TEM quantitativa (ad esempio, bottoni con vescicole e mitocondri o assoni mielinizzati e non mielinizzati) e scatta immagini TEM di questi parametri con ingrandimento di 3.500x, 6.000x e/o 8.000x.

Materials