Imaging al microscopio elettronico a trasmissione dell'endocitosi della vescicola sinaptica nei neuroni dell'ippocampo di topo

Abstract

Fonte: Villarreal, S., et. al., Misurazione dell'endocitosi delle vescicole sinaptiche nei neuroni ippocampali in coltura. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra l'analisi dell'endocitosi delle vescicole sinaptiche nei neuroni ippocampali in coltura attraverso la marcatura della perossidasi di rafano e la microscopia elettronica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

Microscopia elettronica

1. Preparare una soluzione di stimolazione ad alto K⁺ con HRP (perossidasi di rafano) come 31,5 mM di NaCl, 2 mM di CaCl₂, 90 mM di KCl, 25 mM di HEPES (pH 7,4), 30 mM di glucosio, 2 mM di MgCl₂, 0,01 mM CNQX, 0,05 mM AP5 e 5 mg/mL HRP, quindi regolare a pH 7,4 con 5 M NaOH.
   1. Stimolare la coltura del neurone ippocampale con 1,5 mL di soluzione di stimolazione K⁺ a temperatura ambiente (indicata come K⁺) aggiungendo 1,5 mL a ciascun pozzetto per 90 s. Nella condizione di riposo (denominata R), applicare la stessa concentrazione di 5 mg/mL di HRP per 90 s, ma con una soluzione salina normale. Per il campione di recupero, applicare una soluzione di stimolazione ad alto K⁺ come con il campione K⁺, quindi lavare rapidamente e sostituire con soluzione fisiologica normale e incubare per 10 minuti.
2. Fissazione e colorazione
   
   1. Preparare 0,1 M di tampone Na cacodylato utilizzando 21,4 g/L di Na cacodylato a pH 7,4. Fissare le cellule con glutaraldeide al 4% in tampone di cacodilato 0,1 M Na per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Lavare tre volte con tampone di cacodilato 0,1 M Na per 7 minuti ciascuna.
   2. Preparare la soluzione di diaminobenzidina (DAB), composta da 0,5 mg/mL di DAB con 0,3% di H₂O₂ in ddH₂O, e filtrare con un filtro da 0,22 μm. Applicare 1,5 mL di soluzione DAB per 30 minuti a 37 °C. Lavare tre volte con tampone 0,1 M di Na cacodilato per 7 minuti ciascuna.
      ATTENZIONE: Il DAB è un tossico e sospetto cancerogeno. Si prega di utilizzare guanti e camici da laboratorio.
      NOTA: L'etichettatura con DAB avviene a causa della sua ossidazione da parte di H₂O₂, come catalizzato da HRP. Piccoli aumenti dei componenti si traducono in un aumento del segnale nel campione. L'aumento della concentrazione di HRP accelera l'effetto del catalizzatore. Concentrazioni sufficientemente grandi di H₂O₂ consentono reazioni collaterali debilitanti con HRP, inibendo l'effetto dell'etichettatura³². In questo lavoro, le concentrazioni di questo sistema di etichettatura sono state scelte sulla base della ricerca attualmente disponibile.
   3. Incubare i neuroni con 1,5 mL di OsO₄ all'1% in tampone 0,1 M di Na cacodylato per 1 ora a 4 °C come post-fissazione. Lavare tre volte con 1,5 mL di tampone 0,1 M di Na cacodylato per 7 minuti ciascuna.
      ATTENZIONE: A causa della tossicità e della reattività di OsO₄, mantenere il campione sul ghiaccio in una cappa chimica è preferibile in molti casi all'uso di un frigorifero per l'incubazione.
   4. Preparare un tampone 0,1 M di acetato di sodio con 13,61 g/L di acetato di sodio e 11,43 mL/L di acido acetico glaciale a pH 5,0. Lavare tre volte con 1,5 mL di tampone acetato 0,1 M a pH 5,0 per 7 min ciascuna e incubare con 1,5 mL di acetato di uranile all'1% in tampone acetato 0,1 M a pH 5,0 per 1 ora a 4 °C. Lavare tre volte con 1,5 mL di tampone acetato 0,1 M per 7 min ciascuna.
      
3. Inclusione epossidica
   
   1. Disidratare la coltura neuronale con singoli lavaggi da 1,5 mL di etanolo al 50%, 70% e 90%, per 7 minuti ciascuno e poi 3 lavaggi da 1,5 mL di etanolo al 100% per 7 minuti ciascuno in una cappa aspirante.
   2. Miscelare 485 mL/L di resina epossidica bisfenolo-A-(epicloridrina), 160 mL/L di anidride dodecenil succinica (DDSA), 340 mL/L di metil-5-norbornene-2,3-anidride dicarbossilica (NMA) e 15 mL/L di 2,4,6-tris(dimetilamminometil)fenolo (DMP-30) per creare la resina epossidica. Mescolare accuratamente, quindi conservare sottovuoto per eliminare le bolle d'aria.
      NOTA: È fondamentale rimuovere le bolle d'aria nella resina, specialmente quelle più piccole di quelle visibili ad occhio nudo, perché possono causare carie nella resina durante il sezionamento.
   3. Infiltrarsi nel campione sostituendo l'etanolo con il 50% di resina epossidica in etanolo per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore, quindi di resina epossidica al 70% in etanolo per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore.
   4. Sostituire la soluzione di resina epossidica con resina epossidica al 100% e incubare per 10 minuti a 50 °C. Eseguire due scambi di resina epossidica fresca al 100% con incubazioni per 1 ora a 50 °C. Aggiungere resina epossidica fresca al 100% e lasciare indurire a 50 °C per una notte e poi a 60 °C per oltre 36 ore per indurirsi.
4. Rimuovere ogni campione dalla piastra multipozzetto con una sega a mano da gioielliere. Selezionare le regioni di interesse, le concentrazioni dense di cellule, utilizzando un microscopio ottico invertito, quindi tagliare blocchi da 70 a 80 nm per il sezionamento mediante microtomo. Montare la regione tagliata nel mandrino del microtomo e caricare il microtomo. Posizionare il mandrino nel microtomo e montare un coltello diamantato con il bordo parallelo alla superficie del blocco. Raccogli sezioni di spessore da 70 a 80 nm direttamente su singole griglie.
5. Sciogliere l'acetato di uranile in acqua per ottenere una soluzione all'1% in peso e sciogliere separatamente il citrato di piombo in acqua per ottenere una soluzione al 3% in peso. Controcolorare le sezioni mediante immersione con acetato acquoso di uranile all'1% per 15 minuti e poi citrato di piombo acquoso al 3% per 5 minuti per migliorare il contrasto dei campioni.
6. Imaging EM
   1. Esamina le sezioni con un microscopio elettronico a trasmissione e registra le immagini con una fotocamera digitale CCD a un ingrandimento primario di 10.000-20.000X.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049	Terreno di crescita per neuron, Riscaldare fino a 37°C prima dell'uso
B27	Thermo Fisher	17504-044	Gradiente per la differenziazione neuronale
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	Gradiente per la cultura
Tripsina XI da pancreas bovino	Sigma	T1005	Neuronal culture-digest hippocampal tissues
Deossiribonucleasi I dal pancreas bovino	Sigma	D5025	La coltura neuronale inibisce la sospensione
Poly-l-lysine	Sigma	P4832	Microscopia elettronica, substrato per la crescita neuronale, applicare su piastra multipozzetto per 1 ora a temperatura ambiente, quindi lavare con acqua sterilizzata 3 volte
Perossidasi di rafano(HRP)	Sigma	P6782	Microscopia elettronica, marcatura di vescicole sinaptiche endocitose catalizzando DAB in presenza di perossido di idrogeno, la concentrazione finale è di 5 mg/mL in soluzione salina normale, fare fresco prima dell'uso
Sodium cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300	Microscopia elettronica, tampone per fissativi e lavaggio, la concentrazione finale è 0.1 N
3,3'-Diaminobenzidine(DAB)	Sigma	D8001	Microscopia elettronica, etichettatura di vescicole sinaptiche endocitose, substrato per HRP, concentrazione finale è 0.5 mg/mL in DDW e filtrato, fare fresco prima dell'uso
Idrogeno soluzione di perossido	Sigma	H1009	Microscopia elettronica, marcatura di vescicole sinaptiche endocitose inducendo la reazione HRP-DAB, la concentrazione finale è dello 0,3% in DDW, fare fresco prima dell'uso
Glutaraldehyde<	16365	Microscopia elettronica, fissativi, la concentrazione finale è del 4% in tampone Na-cacodylate, fare fresco prima dell'uso, agitare bene prima dell'uso
TEM	JEOL	200CX	Microscopia elettronica, imaging di vescicole endocitose e cambiamenti
CCD digital camera	AMT	XR-100	Microscopia elettronica, acquisizione di immagini
Citrato di piombo	Leica microsystems	16707235	Microscopia elettronica, colorazione a griglia

neuronale cellulare viscosatd style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:111pt;'>Electron Microscopy Sciencesultrastrutturali