Imaging a bioluminescenza della neuroinfiammazione in un topo transgenico

Abstract

Fonte: Breid, S., et. al. Imaging a bioluminescenza della neuroinfiammazione in topi transgenici dopo inoculazione periferica di fibrille di alfa-sinucleina. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra l'imaging a bioluminescenza della neuroinfiammazione nei topi transgenici, mostrando le reazioni luciferasi-luciferina negli astrociti attivati. Il protocollo consente la quantificazione non invasiva dell'attivazione astrocitica, aiutando gli studi sull'infiammazione del SNC e sull'efficacia terapeutica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

Modello animale

1. Intercross topi emizigoti Tg(Gfap-luc+/-) con topi emizigoti Tg(M83+/-) per generare topi emizigoti bigenici Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-).
2. Genotipizzare la progenie con PCR in tempo reale per la presenza del transgene che codifica per l'alfa-sinucleina umana e con PCR standard per la luciferasi delle lucciole.
3. Inoculare gli animali all'età di sei-otto settimane.

Preparazione dell'inoculo

1. Preparare l'alfa-sinucleina umana ricombinante monomerica con la mutazione A53T in tampone salino con tampone Tris (TBS) contenente 150 mM di NaCl in 20 mM di Tris-HCl (pH 7,2).
2. Preparare l'alfa-sinucleina fibrillare per le inoculazioni agitando 3 μg/μL di alfa-sinucleina umana ricombinante monomerica in un agitatore orbitale a 800 giri/min e 37 °C per 5 giorni.
3. Diluire le fibrille in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per raggiungere una concentrazione finale di 1 μg/μL per le inoculazioni intraperitoneali.
4. Frammentare le fibrille di alfa-sinucleina con un sonicatore a bastoncino per 1 minuto (40 impulsi della durata di 0,5 s con una pausa di un secondo tra ogni impulso e ampiezza impostata al 50%) su ghiaccio. Per evitare la contaminazione da semina incrociata. Utilizzare sonde di sonicazione pulite per preparare un inoculo diverso.

Iniezioni intraperitoneali

1. Per le iniezioni intraperitoneali, narcotizzare brevemente gli animali in una camera di anestesia mediante inalazione di isoflurano/ossigeno utilizzando una portata di 2 L/min e il vaporizzatore impostato al 2%. Pizzica il dito del piede dell'animale e verifica che non ritiri l'arto posteriore per garantire un'anestesia adeguata.
2. Riempire una siringa ipodermica monouso da 27 G con 50 μl di fibrille di alfa-sinucleina sonicata o PBS.
3. Iniettare direttamente nel peritoneo del topo ed evitare di penetrare nell'intestino tenue o nel cieco situato dietro la parete addominale tenendo l'animale in posizione dorsale con la testa rivolta lontano dallo sperimentatore e verso il basso a circa 45°. Monitorare gli animali fino a quando non si sono ripresi dall'anestesia.

Imaging a bioluminescenza

1. Image Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) ogni 2-4 settimane utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza.
2. Prima dell'imaging, anestetizzare brevemente i topi in una camera di isoflurano/ossigeno con una portata di 2 L/min e il vaporizzatore impostato al 2%. Pizzica il dito del piede dell'animale e verifica che non ritiri l'arto posteriore per garantire un'anestesia adeguata.
3. Radere e depilare le teste dei topi con una crema depilatoria. Colora le orecchie di nero con un pennarello non irritante per bloccare la bioluminescenza aspecifica.
4. Diluire il sale di potassio D-luciferina, il substrato della luciferasi, in PBS in una soluzione madre da 30 mg/mL. Conservare questo in aliquote da 1 mL a -20 °C. Proteggere la D-luciferina disciolta dall'esposizione alla luce.
5. Pesare gli animali prima dell'iniezione. Calcolare il volume esatto di D-luciferina iniettabile di 150 mg/kg di peso corporeo. Iniettare intraperitonealmente la D-luciferina e riportare l'animale nella camera di anestesia.
6. Avviare il software di imaging. Dopo che il sistema di imaging ha raggiunto la temperatura di esercizio, inizializzare il sistema facendo clic sul pulsante "Inizializza" nel pannello di controllo.
7. Selezionare i pulsanti 'Luminescente' e 'Fotografia'. Impostare il tempo di esposizione su 60 s, il binning su "Medio", l'F/Stop su "1" e il guadagno EM su "Off".
8. Verificare che il filtro di eccitazione sia impostato su "Blocca" e il filtro di emissione su "Aperto" e impostare l'altezza del soggetto su 1,50 cm.
9. Dieci minuti dopo l'iniezione con D-luciferina, posizionare gli animali sulla piastra riscaldante nella camera di imaging e assicurarsi che i loro musi siano posizionati correttamente nell'uscita dell'anestesia. Chiudere il flusso di isoflurano/ossigeno dalla camera di inalazione e aprire il flusso per la camera di imaging con una portata di 0,25 L/min e un'evaporazione del 2%. Chiudere correttamente lo sportello della camera di imaging.
10. Fare clic sul pulsante 'Acquisisci' per misurare la bioluminescenza, che richiede 60 s.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
siringa calibro 27	VWR	613-4900
Isoflurane	Piramal Healthcare	PZN 4831850
Crema depilatoria	Veet		<
Neolab	25040
D-luciferina sale di potassio	Acris	LK10000	30 mg/mL soluzione
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonicatore Sonopuls Mini20	Bandelin	3648	<
PerkinElmer
Living Image 3.0 Software	PerkinElmer
Tg(M83+/-) mouse o B6; C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice	The Jackson Laboratory	4479

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