Marcatura retrograda dei motoneuroni di Drosophila utilizzando coloranti lipofili fluorescenti

Abstract

Fonte: Inal, M. A. et. al., Tracciamento retrogrado di Drosophila motoneuroni embrionali utilizzando coloranti fluorescenti lipofili. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra il metodo di marcatura retrograda dei motoneuroni Drosophila utilizzando coloranti lipofili. Il colorante entra nell'assone, viaggia retrogradamente ed etichetta i neuroni in verde, consentendo una visualizzazione dettagliata della loro morfologia e delle proiezioni al microscopio confocale.

Protocollo

1. Attrezzature e forniture

1. Materiali per la raccolta di embrioni e l'addestramento degli adulti a deporre le uova
   1. Preparare l'apparato di filtrazione recidendo una provetta da 50 ml e aprendo un foro nel tappo per posizionare un filtro a rete con pori di 100 μm (Tabella dei materiali) tra la provetta e il tappo.
      NOTA: In alternativa, per la fase di filtrazione della raccolta degli embrioni possono essere utilizzati filtri cellulari con pori di 100 μm ( Tabella dei materiali).
   2. Prepara le piastre di agar con la premiscela di agar d'uva (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni elencate. Mescolare brevemente, mescolare delicatamente una bustina della miscela in polvere in 500 ml di acqua distillata a temperatura ambiente (RT, 23 °C) (dH₂O) e cuocere la miscela disciolta nel microonde fino a un'ebollizione vigorosa. Dopo aver raffreddato a 70-75 °C, versare il composto in piastre di Petri (60 mm). Dopo che l'agar si è solidificato, conservare le piastre a 4 °C.
   3. Preparare la pasta di lievito mescolando lievito secco attivo (Tabella dei materiali) e acqua fino a ottenere una consistenza pastosa, e mantenere a 4 °C.
   4. Utilizzare gabbie per la raccolta delle uova (per piastre di Petri da 60 mm, Tabella dei materiali) che forniscono un flusso d'aria sufficiente.
      
2. Preparazione degli aghi di dissezione e delle micropipette per iniezione di colorante
   1. Preparare la micropipetta per iniezione di colorante e l'ago di dissezione dallo stesso tubo capillare con un diametro interno di 0,6 mm e un diametro esterno di 1,2 mm (Tabella dei materiali). Tirare il tubo capillare con un estrattore per micropipette al 7% a partire dalla massima uscita di 170 V (Tabella dei materiali) per creare un ago affilato con una conicità di ~0,4 cm di lunghezza.
   2. Per l'iniezione del colorante, regolare la micropipetta con una micropipetta smussata (Tabella dei materiali) con una tecnica di smussatura a bolle descritta nel manuale dello strumento.
      1. In breve, immergere il macinino con un agente umettante ( Tabella dei materiali) per evitare che l'acqua "trascini" la punta dell'ago. Posizionare l'ago sulla pinza per micropipette a 25-30° e abbassare la punta su due terzi del raggio fuori dal centro della superficie di smussatura. Macinare l'ago mentre una siringa con tubo spinge l'aria nell'ago per garantire che la micropipetta sia priva di trucioli di vetro.
      2. Contrassegnare la micropipetta con un pennarello indelebile a punta fine per indicare la posizione dell'apertura sulla punta dopo la smussatura, poiché è difficile individuare l'apertura stretta della micropipetta che si forma ad angolo.

2. Preparazione per la raccolta degli embrioni

1. Assicurarsi che i moscerini adulti (20-40 mosche wild-type Canton-S o mosche bianche), maschi e femmine, siano mantenuti in condizioni giovani (<7 giorni) e sane per la raccolta ideale degli ovuli.
   NOTA: Per stimolare la deposizione delle uova, le mosche vengono addestrate nella loro gabbia di raccolta delle uova un paio di giorni prima della raccolta delle uova su piastre di agar striate di pasta di lievito almeno una volta al giorno.

3. Stadiazione dell'embrione

1. Consenti ai moscerini di deporre le uova durante la notte (o almeno 15 ore) a RT per raccogliere gli embrioni a 15 ore dopo la deposizione delle uova (AEL), cioè allo stadio 16, per visualizzare la dendritogenesi dei motoneuroni della cellula d'angolo anteriore (aCC) e del gambero crudo 3 (RP3). Al mattino, raccogli il piatto con le uova.
   NOTA: Gli embrioni a 15 ore AEL avranno un intestino distinto a 4 camere. Per l'imaging le diverse fasi seguono i loro specifici criteri morfologici e le condizioni di invecchiamento.
2. Per raccogliere gli embrioni, deteroionare le uova deposte sulla piastra con il 50% di candeggina per 5 minuti.
3. Una volta che i corioni si sono liberati, versare il contenuto della piastra attraverso l'apparecchio di filtrazione o il colino cellulare per isolare gli embrioni. Usando una bottiglia d'acqua a pressione, diluire la candeggina rimasta sulla piastra e raccogliere il maggior numero possibile di embrioni travasando la miscela nel filtro.
4. Lavare gli embrioni sul filtro 3-4 volte con altra acqua o fino a quando l'odore di candeggina non si dissipa. Rimuovere il filtro dall'apparecchio e lavare gli embrioni su un'altra piastra pulita con acqua. Decantare l'acqua dalla nuova piastra su cui si trovano gli embrioni.
5. Preparare un vetrino coprendolo con due strati di nastro vinilico al centro, formando un rettangolo. Taglia una piscina rettangolare dal nastro usando una lama di rasoio. Posiziona una sottile striscia di nastro biadesivo verso l'estremità superiore della piscina, è qui che verranno posizionati gli embrioni come mostrato in Figura 1.
6. Utilizzando una pinza fine, selezionare individualmente 5-10 embrioni a 15 ore AEL e posizionarli sul nastro biadesivo con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Aggiungere la soluzione salina di Ringer per insetti al pool di dissezione per proteggere gli embrioni dall'essiccazione (Figura 1).

4. Dissezione e colorazione

1. Utilizzando un ago di vetro al microscopio da dissezione (Tabella dei materiali), tagliare la linea mediana di un singolo embrione sulla sua superficie dalla sua estremità posteriore a quella anteriore. Quindi trascinare l'embrione fuori dalla membrana vitellina dal nastro sul vetro (inscatolato in Figura 1). Fare attenzione a non danneggiare i tessuti interni dell'embrione.
2. Capovolgere i tessuti epiteliali dal centro e attaccare il bordo epidermico sulla superficie del vetrino (Figura 1, riquadro).
3. Utilizzando un ago collegato a un tubo con un'apertura della punta di ~300 μm (preparato rompendo la punta sottile di un ago di dissezione), aspirare o soffiare aria per staccare e rimuovere i tronchi tracheali longitudinali dorsali e le viscere rimanenti.
4. Utilizzare il 4% di paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per fissare gli embrioni per 5 minuti a RT. Lavare gli embrioni 3 volte con PBS.
5. Colorare gli embrioni con 1 μL di anticorpo anti-perossidasi rafano coniugato con colorante cianina 3 (anti-HRP Cy3) (Tabella dei materiali) in 200 μL di PBS per 1 ora. Lavare gli embrioni con PBS 3x dopo la colorazione.
   NOTA: Il colorante anti-HRP può essere cambiato in base ai coloranti lipofili di scelta per l'iniezione.

5. Riempimento della micropipetta per iniezione

1. Coloranti lipofili a caldo (5 mg/mL di 3,3'-diottadilossacarbocianina, perclorato (DiO) o 1,1′-diottadil-3,3,3′-tetrametilindodicarbocianina, sale di 4-clorobenzensolfonato (DiD), Tabella dei materiali) a 60 °C in una miscela 1:10 di etanolo: olio vegetale prima dell'uso.
2. Preparare un vetrino di colorante disciolto in olio per la micropipetta per iniezione. Posizionare la micropipetta nel supporto del capillare (Figura 2, #1). Utilizzando il micromanipolatore (Tabella dei materiali), regolare la micropipetta in modo che si trovi sopra il vetrino del colorante. Quindi, regolare il tavolino per posizionare la micropipetta sul colorante (Figura 2, #2).
3. Per riempire la micropipetta, utilizzare un microiniettore (Tabella dei materiali) (Figura 2, #3). Raccogliere il colorante nella micropipetta impostando P_i (pressione di iniezione) tra 200-500 hPa (ettopascale), T_i (tempo di iniezione) tra 0,1-0,5 s e P_c (pressione di compensazione) su 0 hPa per 5 minuti (Figura 2, #4).
4. Una volta raccolto il colorante, rimuovere il vetrino e posizionare il campione sul tavolino del microscopio. Quindi, aumentare il Pc a un intervallo di 20-60 hPa prima di abbassare la micropipetta nel campione per prevenire la contaminazione della PBS per azione capillare.

6. Iniezione di colorante nei neuroni

1. Localizzare l'embrione al centro utilizzando il microscopio con obiettivo 10x (Tabella dei materiali) e allineare la micropipetta con l'embrione.
   NOTA: La dimensione della gocciolina di colorante può essere regolata modificando il Pi greco o la dimensione dell'apertura della punta della micropipetta. La gocciolina dovrebbe essere di 10-20 μm, che è approssimativamente la larghezza di 1 muscolo.
2. Cambia la lente dell'obiettivo con una lente 40x a immersione in acqua (Tabella dei materiali) e immergi la lente in PBS per vedere l'embrione.
   1. Utilizzare la microscopia a fluorescenza per controllare la morfologia neuronale contrassegnata da anti-HRP Cy3 e determinare il sito di iniezione.
   2. Durante l'iniezione, utilizzare la microscopia in campo chiaro per vedere la gocciolina di colorante. Quando l'embrione è a fuoco, cambiare la posizione della micropipetta per stabilire un contatto delicato con la punta dell'assone di interesse (ad esempio, aCC, RP3).
   3. Far cadere il colorante in un emisegmento addominale destro (A2-A6) alla giunzione neuromuscolare di aCC o RP3 (Figura 3) con DiD o DiO, utilizzando i neuroni marcati da anti-HRP Cy3. Utilizzando la pulsantiera (mouse; Figura 2, 5) rilasciare il colorante e rimuovere la micropipetta dopo aver fatto cadere il colorante con il micromanipolatore e passare al sito di iniezione successivo.
      NOTA: A differenza di altri coloranti (ad esempio, il giallo di Lucifero, la calceina) che si diffondono nelle cellule vicine attraverso giunzioni a fessura, i coloranti lipofili si associano alle membrane cellulari e non si trasferiscono alle vicine. A causa delle dimensioni relativamente grandi della gocciolina di colorante, tuttavia, questa tecnica comporta anche l'etichettatura dei muscoli partner (Figura 3A).
3. Incubare il campione a RT per 1 ora dopo la goccia di colorante prima dell'imaging.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui prima del montaggio e il campione può essere conservato a 4 °C durante la notte. I coloranti lipofili possono anche essere somministrati utilizzando la ionoforesi se è prontamente disponibile un amplificatore intracellulare ad accoppiamento diretto (DC).

7. Imaging con un microscopio confocale

1. Rimuovere il nastro biadesivo e il nastro in vinile dal vetrino con l'aiuto di una pinza.
2. Preparare un vetrino coprioggetto (22 x 22 mm2 No.1 cover glass) con una piccola quantità di grasso sottovuoto ( Tabella dei materiali) ai quattro angoli e posizionarlo con cura sul campione, evitando bolle d'aria. Rimuovi il PBS in eccesso utilizzando i tergicristalli delle attività.
3. Spingere verso il basso il vetrino coprioggetti per regolare la distanza di lavoro tra la lente dell'obiettivo e il campione. Sigillare completamente i bordi del vetrino coprioggetti con lo smalto.
4. Immagine con ingrandimento 10x e 100x utilizzando un microscopio confocale.

Risultati

Figura 1: Allestimento della vasca di dissezione. La camera blu che si vede sul vetrino è creata con del nastro in vinile che mantiene i tamponi all'interno. Il nastro biadesivo trattiene gli embrioni che sono correttamente al...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti obiettivo 10x lensNikon Planlente ad immersione in acqua 40xNikonNIR ApoTubo capillareFrederick Haer&Co27-31-1 Microscopio confocaleAndorN/AUnità confocale del disco rotante LibellulaVetro di coperturaCorning 22x22 mm Quadrato #1DiDThermoFisherV22886 DiIThermoFisherV22888ThermoFisher style='colore-sfondo:#ffffff;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:fondo;'>V22887 Microscopio da dissezione style='colore-sfondo:#ffffff;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:fondo;'>N/ASMZ-UNastro biadesivoScotch665 Dow corning grasso per alto vuotoFisher Sci.14-635-5D <td style='colore di sfondo:#ffffff;padding:0px 3px;allineamento verticale:bottom;'>Dumont #5 Pinze<td style='colore di sfondo:#ffffff;padding:0px 3px;align-vertical:bottom;'>Strumenti di Fine Science11252-20Gabbia di raccolta delle uovaFlyStuff style='colore di sfondo:#ffffff;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:fondo;'>59-100 FemtoJet 5247Eppendorffuori produzioneFemtoJet 4i (Gatto n. 5252000021)MicromanipolatoreSutterMP-225 Smussatrice per micropipetteSutterBV-10-B Estrattore di aghiNarishigePC-100 Pacchetti di premiscelazione in polvere di agar d'uva Nutri-flyFlyStuff47-102 Filtro rete di nylonMillipore Scienze di microscopia elettronica15710Qualsiasi grado EMPBSRoche11666789001Venduto su sigmaaldrich, soluzione in scatola 10xPhoto-Flo 200Kodak146 4510Agente bagnanteMicroscopio a fluorescenza verticaleNikonN/AEclipse Ci con una sorgente luminosa a LEDNastro isolante in vinileScotch6143VWR10199-659 <td style='colore di sfondo:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>YeastFlyStuff62-103lievito secco attivo (STELLA ROSSA)