Microscopia a immunofluorescenza di cellule neurali differenziate da cellule derivate dal sangue periferico

Abstract

Fonte: Becker-Kojić, Z. A., et. al., Generazione libera da OGM di cellule neuronali derivate dal sangue. J. Vis. Exp. (2021)

Il video mostra un protocollo per la preparazione di cellule neurali derivate da cellule del sangue periferico riprogrammate per la microscopia a fluorescenza, mostrando tipi cellulari distinti e fasi di sviluppo attraverso l'imaging a immunofluorescenza.

Protocollo

1. Analisi al microscopio a immunofluorescenza di cellule neurali derivate dal sangue
   1. Coltivare le cellule per 16 giorni e rimuovere il terreno.
      1. Incubare con fissativo preriscaldato costituito da 75 mL di acqua sterile, 4 g di paraformaldeide. Aggiungere 10 N di NaOH se necessario e mescolare fino a quando la soluzione non si chiarisce. Quindi aggiungere 10 ml di PBS 10x, 0,5 ml di MgCl₂, 2 ml di EGTA 0,5 M e 4 g di saccarosio. Titolare a pH 7,4 con 6 N HCl e portare a 100 mL di acqua sterile per 15 min.
      2. Scartare il fissativo e lavare le cellule 3 volte per 5 min ogni volta. Aggiungere immediatamente una soluzione di Triton X allo 0,3% appena preparata e permeabilizzare le cellule per 5 minuti. Lavare 3 volte con PBS e aggiungere una soluzione bloccante a base di PBS e 5% BSA.
      3. Bloccare le celle a temperatura ambiente su una piastra a bilanciere per 1 ora.
      4. Preparare le diluizioni appropriate degli anticorpi in BSA/PBS all'1% e incubare le cellule con diluizioni anticorpali su una piastra a bilanciere per 1,5 ore a temperatura ambiente. Lavare le cellule 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuna, incubare le cellule con DAPI e montare i vetrini coprioggetti con i mezzi di montaggio per la visualizzazione su un microscopio.
         NOTA: Gli anticorpi direttamente marcati utilizzati in questo esperimento sono elencati nella Tabella dei materiali.

Materiali