Analisi delle strutture amiloidi in una sezione di tessuto mediante microscopia a fluorescenza con imaging a vita

Abstract

Fonte: Nyström, S., et al., Imaging di tessuti amiloidi colorati con oligotiofeni coniugati luminescenti mediante microscopia confocale iperspettrale e imaging del tempo di vita della fluorescenza. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video mostra l'analisi delle strutture amiloidi con la microscopia a fluorescenza o FLIM, utilizzando il colorante hFTAA per rivelare nuclei compatti come blu/verde e periferie instabili come rosso/giallo in immagini codificate a colori, riflettendo l'organizzazione dell'amiloide.

Protocollo

1. Preparazione di campioni di tessuto

NOTA: Molti tipi di tessuto possono essere visualizzati utilizzando l'acido acetico eptamero-formil tiofene (hFTAA) come marcatore amiloide. L'hFTAA è sensibile alla conformazione aggregata. La colorazione dovrebbe, quindi, essere preferibilmente eseguita su aggregati non interrotti senza esposizione all'epitopo. La qualità spettrale ottimale si ottiene se la fissazione tissutale è ridotta al minimo. Pertanto, è preferibile il materiale fresco congelato, fissato delicatamente in etanolo al momento della colorazione. Tuttavia, è possibile rilevare depositi di amiloide anche in tessuti che sono stati fissati con , ad esempio , formalina. L'hFTAA generalmente penetra bene nel tessuto. Selezionare uno spessore del campione compatibile con la tecnica di imaging prevista.

1. Se si utilizzano sezioni fissate in formalina e incluse in paraffina, queste devono essere deparaffinizzate in xilene durante la notte. Quindi, immergere le sezioni in bagni consecutivi di etanolo al 99%, etanolo al 70%, dH₂O e soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10 minuti in ciascuno. Lasciare asciugare le sezioni di tessuto in condizioni ambientali.
   Attenzione: Lo xilene viene sempre maneggiato in una cappa chimica. Lo xilene e altri solventi organici sono dannosi.
   1. Scongelare le criosezioni a temperatura ambiente. Fissare le sezioni di tessuto in formalina al 10% durante la notte e reidratarle immergendole in bagni consecutivi di etanolo al 99%, etanolo al 70%, dH₂O e PBS, 10 minuti in ciascuno. Lasciare asciugare le sezioni di tessuto in condizioni ambientali.
2. Aggiungere goccioline della soluzione di lavoro hFTAA (circa 200 μL) alle sezioni di tessuto per coprirla. La gocciolina dovrebbe rimanere in posizione grazie alla tensione superficiale. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per la colorazione.
3. Sciacquare la soluzione colorante con 500 μL di PBS utilizzando una pipetta e quindi immergere il vetrino nel bagno PBS per 10 minuti. Lasciare asciugare la sezione in condizioni ambientali.
4. Montare utilizzando il mezzo di montaggio a fluorescenza. Lasciare che il supporto di montaggio si depositi durante la notte.

2. FLIM
NOTA: Il microscopio confocale è dotato di un'unità di microscopia per imaging a fluorescenza (FLIM).

1. Impostare i seguenti parametri per il microscopio confocale: foro stenopeico, 20; lunghezza d'onda di eccitazione, 490 nm; intensità laser, 0,5% (corrispondente a una potenza media di 7,5 μW). Utilizzare laser pulsati a 40 MHz.

2. Nel software FLIM, impostare il conteggio dei fotoni oltre i 550 nm. Nella finestra Parametri di visualizzazione, seguire il conteggio dei fotoni fino a quando il conteggio massimo è di circa 4.000 conteggi di fotoni.

3. Salvare il file ed esportarlo come immagine SPC (Single-Photon Counting).

4. Adattare i dati a un decadimento esponenziale a 2 componenti nel software FLIM. Un adattamento che dà un χ² < 2 è buono. Il valore sull'asse y è il numero di conteggi per la durata specificata.

5. Seleziona una soglia per i conteggi da includere, , ad esempio , 100. Codice colore per T1 e intervallo di durata selezionato. Il decadimento dipende dalla struttura amiloide in cui è legato l'hFTAA. Sono stati osservati tempi di vita della fluorescenza compresi tra 300 e 1.000 ps. Salva il file.

6. Esportare i dati grezzi utilizzando le opzioni di esportazione e salvare i dati desiderati in una nuova cartella.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Dako Fluorescene montaggio Medium	Tecnologie Agilent	GM304
LeicaDM6000	Leica
Lumen 200	Prior
Spectraview system	ASI spectral imaging
Spectraview software	ASI spectral imaging
LSM780	Zeiss
Zen 2010b v6.0 software	Zeiss
FLIM system	Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
Tunable Laser In Tune	Zeiss