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1.Live Registrazione immagini
- Preparazione delle celle per l'imaging dal vivo
1. Coltura di cellule neuronali ipotalamiche WT e CCR5-/- che esprimono il trasportatore del glucosio marcato con la proteina a fluorescenza verde 4 (GFP-GLUT4) sul vetrino coprioggetti #1,5 (o 0,17 mm di spessore) che è stato pre-rivestito con poli-D-lisina nella piastra a 6 pozzetti.
2. Rimuovi con cura i vetrini con i neuroni usando una pinza e posizionali sui vetrini con cautela.
3. Rimuovi il mezzo/liquido in eccesso con salviette delicate. Piega le salviette due volte e posizionale con cura sopra il vetrino coprioggetti. Premere delicatamente le salviette senza spostare il vetrino coprioggetti.
ATTENZIONE: Non premere con forza il vetrino contro il vetrino. Lo scopo di questa fase è garantire che il vetrino coprioggetti non si muova/si sposti durante l'acquisizione dell'immagine a causa della forza di galleggiamento.
4. Posiziona i vetrini coprioggetti e i vetrini sul tavolino del microscopio di deconvoluzione, con il vetrino rivolto verso il basso, e fissali correttamente. Questo passaggio serve a garantire che la posizione della diapositiva rimanga costante in modo che gli utenti possano tenere traccia dello stesso set di celle di destinazione in un secondo momento.
5. Osserva le cellule neuronali ipotalamiche WT e CCR5-/- con un obiettivo a immersione in olio 60x/1.42 NA.
6. Trattare i campioni di cellule selezionati con CCL5 (10 ng/mL) o insulina (10 U/mL) per un minuto. Aggiungere 1,5 μL di insulina diluita sul bordo del vetrino coprioggetti.
7. Visualizza e registra immediatamente i campioni di cella selezionati. Programma il software di registrazione video per registrare per 30 minuti.
2. Microscopia e analisi della deconvoluzione
NOTA: Questa parte del protocollo richiede l'uso di un microscopio di deconvoluzione e di un software specializzato per l'analisi.
1. Accendi il sistema di imaging, lascia che il tavolino del microscopio venga inizializzato correttamente, quindi accendi la sorgente luminosa a LED.
2. Aggiungi olio da immersione (indice di rifrazione 1.520 per campioni vivi a 37 °C) su una lente obiettivo 60x 1.42 NA. Posizionare il vetrino sul microscopio con il vetrino coprioggetti rivolto verso la lente dell'obiettivo e fissarlo correttamente.
3. Usa l'illuminazione a campo chiaro o a fluorescenza per identificare le celle target. Regolare la messa a fuoco fino a quando le cellule bersaglio non possono essere osservate chiaramente. Non spostare la lente dell'obiettivo al di fuori dell'area del vetrino coprioggetti per evitare inutili graffi
.
4. Identifica la proteina di fluorescenza verde coniugata con il trasportatore di glucosio 4 (GFP-GLUT4) dal segnale GFP. Identificare le cellule target desiderate per l'acquisizione dell'immagine. La posizione della cella target selezionata può essere memorizzata per riferimento futuro (vedere la Figura 1).
5. Imposta i parametri sperimentali appropriati (incluso il numero di pixel, la lunghezza d'onda di eccitazione, la percentuale di trasmissione, il tempo di esposizione, lo spessore della pila, l'intervallo di tempo e il tempo totale di imaging) su ogni cella target. Per questo esperimento, il numero di pixel dell'immagine è stato impostato su 512 x 512 (può essere impostato su 1.024 x 1.024 per una risoluzione più elevata) per i segnali GFP. Il tempo di esposizione è stato impostato tra 0,025 e 0,05 s per ogni 5 minuti. Le piccole regolazioni laterali x, y e z possono essere controllate dal software consigliato (vedere la tabella dei materiali).
6. Imposta il parametro di esposizione a circa 2.000-3.000 conteggi per ottenere la massima intensità di pixel. Per ridurre al minimo il fotosbiancamento della fluorescenza, ridurre il più possibile la percentuale di trasmissione della luce di eccitazione mantenendo il tempo di esposizione inferiore a 1 s. Ripetere questi passaggi per ogni canale di fluorescenza aggiuntivo e per ogni singola area di interesse.
7. Imposta il limite superiore e inferiore della pila Z su ogni cella di destinazione. Ciò può essere ottenuto spostando il tavolino del microscopio fino a quando la parte superiore e inferiore della cellula bersaglio non sono entrambe leggermente sfocate. Gli utenti possono regolare la risoluzione dell'asse Z impostando il numero di immagini tra il limite superiore e inferiore (che può essere fatto impostando la distanza tra ciascuna immagine).
8. Pile di immagini sono state deconvolute e successivamente analizzate con l'aiuto del rispettivo software - Velocity di PerkinElmer in questo caso.
