Analisi microscopica delle sinapsi in fette di ippocampo di topo mediante immunofluorescenza

Abstract

Fonte: McLeod, F., et al. Valutazione della densità delle sinapsi nelle fette di cervello di roditori ippocampali. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video mostra un metodo per visualizzare i marcatori sinaptici in fette di cervello ippocampale utilizzando l'analisi di immunofluorescenza confocale. Le fette sono immunocolorate con anticorpi primari mirati a marcatori presinaptici e postsinaptici, seguiti da anticorpi secondari coniugati con fluorofori. I marcatori marcati vengono quindi visualizzati utilizzando la microscopia confocale per valutare l'architettura sinaptica attraverso la loro colocalizzazione.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione acuta della fetta di ippocampo

Rimuovi il cervello del topo il più rapidamente possibile, usando una spatola e forbici affilate per tagliare il cranio, e mettilo nel liquido cerebrospinale artificiale ghiacciato, ossigenato (95% O₂, 5% CO₂), ad alto contenuto di saccarosio (ACSF, ~100 mL).

2. Posiziona il cervello del topo su una capsula di Petri e rimuovi il cervelletto e una piccola sezione della corteccia frontale con un bisturi prima di emisectare lungo la linea mediana del cervello.
3. Posiziona i due emisferi sul lato che è stato appena tagliato e incolla ogni emisfero sul palco di un vibratomo.
4. Taglia sezioni spesse 200 - 300 μm dell'intera regione di interesse. Nel caso dell'ippocampo, si dovrebbero ottenere circa 3 - 4 fette per emisfero.
5. Utilizzando una pipetta di plastica Pasteur, trasferisci le fette in una camera immersa in ACSF ossigenato (95% O₂, 5% CO₂). Mantenere a 34 °C per 30 min.
   NOTA: In questa fase, le fette possono essere trattate con agenti farmacologici attivi, come le proteine ricombinanti di Dickkopf-1 (Dkk1), aggiungendo gli agenti alla camera della fetta.
6. Usando un pennello, rimuovi le fette dalla camera, mettile in una piastra a 24 pozzetti e fissale per 20 minuti a 1 ora in 4% di paraformaldeide (PFA)/4% di saccarosio a temperatura ambiente (RT).
   Attenzione: il PFA è tossico, indossa una protezione adeguata.
7. Lava le fette tre volte in soluzione salina tamponata con fosfato 1X (PBS, 10 min ciascuna).
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui per 1 - 2 giorni, purché le fette siano mantenute a 4 °C in 1X PBS.

2. Immunofluorescenza per marcatori sinaptici

NOTA: Le ricette di tutti i buffer utilizzati possono essere trovate nella Tabella 1.

1. Nei pozzetti della fetta, sostituisci il PBS con un tampone bloccante/permeabilizzante (Tabella 1) e incuba a RT per 4 - 6 ore.
2. Diluisci l'anticorpo policlonale del porcellino d'India contro il trasportatore vescicolare del glutammato 1 (vGlut1) a una diluizione 1:2.000 in tampone di blocco/permeabilizzazione.
   NOTA: vGlut1 è un marcatore per la visualizzazione del terminale eccitatorio pre-sinaptico. Per l'identificazione delle sinapsi eccitatorie post-sinaptiche, utilizzare un anticorpo policlonale contro la densità-95 postsinaptica (PSD-95) e diluire 1:500 nella stessa soluzione. Utilizzare un volume minimo di 300 μl in ogni pozzetto. Per identificare la posizione anatomica dell'ippocampo, utilizzare un anticorpo in grado di identificare anche la struttura neuronale, come la proteina 2 associata ai microtubuli (MAP2) o la tubulina. Elaborare le concentrazioni corrette di tutti gli anticorpi primari per i marcatori sinaptici di scelta (pre e post-sinaptici) e diluire in un tampone bloccante/permeabilizzante fresco.
3. Incuba le fette nella soluzione di anticorpi primari durante la notte (o per 1 - 2 giorni) a 4 °C. Usa una piattaforma di agitazione con movimento vigoroso.
4. Lava le fette tre volte in PBS (10 min ciascuna).
5. Diluisci gli anticorpi secondari appropriati 1:500 nel tampone di blocco. Ad esempio, quando si utilizza l'anticorpo vGlut1 per porcellini d'India, applicare un anticorpo secondario che riconosca la componente del porcellino d'India (ad esempio, l'anti-porcellino d'India asino) coniugato a uno specifico fluoroforo. Quando si utilizza l'anticorpo di coniglio PSD-95, applicare un anticorpo secondario che riconosca la componente di coniglio (ad esempio, anti-coniglio asino) coniugata a un diverso fluoroforo specifico.
6. Incuba le fette in questa soluzione per 2 - 3 ore a RT. Assicurati che le fette siano protette dalla luce, poiché gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce.
7. Lava le fette tre volte in PBS (10 min ciascuna).
8. Rimuovi con cura le fette dalla piastra a 24 pozzetti usando un pennello e posizionale uniformemente su vetrini pre-etichettati. Aggiungere una goccia di terreno di montaggio sopra ogni fetta e poi posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti di vetro sopra le fette. Evitare la formazione di bolle d'aria. Fare attenzione a utilizzare una quantità sufficiente di terreno di montaggio (300-400 μL), poiché una quantità insufficiente potrebbe portare a fette secche.
9. Lasciare asciugare per un minimo di 1 - 2 giorni a RT e mantenere le diapositive al riparo dalla luce.
10. Conserva le diapositive a 4 °C a breve termine, ma per la conservazione a lungo termine, mantienile a -20 °C.

3. Acquisizione e analisi

1. di immagini confocaliImaging utilizzando la microscopia a scansione laser confocale.
   1. Identifica la regione dell'ippocampo da fotografare (ad esempio, le ammonidi 1 e 3 (CA1, CA3) o il giro dentato (DG)) per mezzo di un obiettivo 10x o 20x.
   2. Passa a un obiettivo a immersione in olio 40x o 63x per assicurarti che l'anatomia della fetta sia intatta identificando neuriti continui e struttura organizzata. Utilizzare un marcatore neuronale, come MAP2, come riferimento (Figura 1A).
   3. Successivamente, passa a un obiettivo a immersione in olio 60x (apertura numerica [NA] = ~1.3 - 1.4) e regola le impostazioni per ogni canale per ottenere un segnale e un contrasto ottimali. Utilizzare un'opzione di contrasto alto/basso per impostare l'intensità di ciascun laser in modo da evitare la saturazione di qualsiasi pixel.
      NOTA: Queste impostazioni dipenderanno dal microscopio utilizzato, ma fai riferimento alla Tabella dei materiali per le impostazioni di potenza del laser. Per ottenere risultati ottimali, utilizza una risoluzione di 1024 x 1024 pixel. Le impostazioni dovrebbero rimanere costanti durante le diverse condizioni dello stesso esperimento. Se necessario, è possibile applicare uno zoom aggiuntivo.
   4. Valuta la profondità dove la colorazione è uniforme e acquisisci pile di immagini di almeno 8 piani equidistanti (250 nm). Quindi prendi 3 pile di immagini rappresentative adiacenti dalla stessa area di interesse per sezione.
      NOTA: La profondità può variare da una fetta all'altra, ma dovrebbe sempre essere a circa 2 - 5 μm dalla superficie della fetta.
   5. Ripeti l'acquisizione in almeno 3 fette per condizione e da 6 a 8 animali per gruppo di trattamento.

Tabella 1: Tamponi utilizzati per la colorazione immunofluorescente.

KCl KH₂PO₄ pH a 7.4

Blocco/permeabilizzazione Buffer	Concentrazione	Notes
siero d'asino	10%
Triton-X	0.50%
PBS	1x
10x PBS		pH a 7.4
NaCl	1.37 M	<
27 mM
NaH2PO4	100 mM
18 mM		4% PFA/4% Saccarosio	<
PBS	1x	Diluisci da 10x
PFA	1.33 M
Sucrose	117 mM

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Results

Tabella 1: Tamponi utilizzati per la colorazione immunofluorescente.

Blocking/permeabilizing Buffer

Materials