Imaging confocale del movimento mitocondriale all'interno di oligodendrociti in colture organotipiche di fette cerebrali

Abstract

Fonte: Kennedy, L. H., et. al. Visualizzazione e imaging dal vivo di organelli di oligodendrociti in fette di cervello organotipiche utilizzando virus adeno-associati e microscopia confocale. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra l'imaging dei mitocondri degli oligodendrociti in fette di cervello di topo organotipiche. La fetta viene posta all'interno di una camera a bagno con circolazione continua del fluido e temperatura controllata. Dopo aver impostato vari parametri del microscopio confocale, vengono acquisite immagini time-lapse dei mitocondri con fluorescenza rossa, seguite da immagini Z-stack dell'oligodendrocita con fluorescenza verde.

Protocollo

1. Preparazione di fette organotipiche

NOTA: Questa ricetta utilizza due cuccioli di topo al giorno postnatale 7-9 (p7-9), producendo 24 fette organotipiche divise in due piastre di coltura a sei pozzetti. Salvo diversa indicazione, tutte le procedure devono essere eseguite in un cappuccio sterile e devono essere utilizzati guanti in nitrile o lattice. Devono essere utilizzati solo ingredienti di coltura cellulare.

1. Per la preparazione della fetta sono stati utilizzati flaconi per autoclave, strumenti di dissezione (1 forbice grande, 1 forbice piccola, 1 spatola piatta grande, 1 spatola piccola arrotondata e affilata e 1 pinza; vedere l'elenco dei materiali per i dettagli), pipette di vetro, puntali per pipette e salviette in tessuto.
2. Poiché metà delle pipette di vetro devono essere utilizzate con l'apertura grande, rompere l'estremità stretta.
   1. Incidere con una penna a diamante (se disponibile) attorno alla pipetta appena sotto il punto in cui il bicchiere inizia a restringersi. Quindi, posizionare l'estremità appuntita della pipetta in un guanto di nitrile o simile. Rompere con cautela la punta piegando la pipetta mentre la si spinge contro un banco da lavoro.
   2. Quindi, smussare l'estremità rotta strofinandola su un pezzo di carta vetrata o scioglierla leggermente su un bruciatore Bunsen. Le pipette rotte vengono utilizzate per trasferire le fette di cervello tagliate, con l'estremità rotta trasformata nel bulbo di gomma e l'estremità grande aperta che tocca la soluzione/le fette.
      NOTA: Questo non viene fatto in una cappa sterile e può essere fatto con diversi giorni di anticipo.
3. Prepara piatti di cultura.
   NOTA: Questo può essere fatto il giorno prima dell'affettatura o almeno 2 ore prima dell'affettatura.
   1. Sterilizzare le membrane in politetrafluoroetilene (PTFE) ("coriandoli"). Usa due pinze sterili per rimuovere un singolo coriandolo dai pezzi di plastica blu circostanti. Quindi, sterilizzare immergendolo due volte in una capsula di Petri contenente il 96% di etanolo (EtOH). Quindi, adagiare i coriandoli in una grande capsula di Petri sterile ad asciugare.
      NOTA: I coriandoli sono membrane idrofile in PTFE simili alle membrane negli inserti di coltura. L'uso di coriandoli aiuta l'imaging dal vivo perché le singole fette possono essere facilmente trasferite dall'inserto alla configurazione del microscopio sollevando i coriandoli con una pinza (vedere 4.8. per i dettagli). In alternativa, le fette di cervello possono essere coltivate senza i coriandoli (in cui le fette si attaccheranno direttamente alla membrana dell'inserto di coltura). In questo caso, l'inserto della membrana deve essere tagliato con un bisturi per trasferire la fetta nel bagno del microscopio.
   2. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura a ciascun pozzetto delle piastre di coltura a sei pozzetti.
   3. Posizionare un inserto di coltura in ciascun pozzetto utilizzando una pinza sterile. Evitare la formazione di bolle d'aria tra l'inserto e il terreno di coltura.
      NOTA: Per risparmiare denaro e l'ambiente, è possibile riutilizzare gli inserti di coltura. Questo può essere fatto mediante un accurato risciacquo in acqua distillata (dH₂O) seguito da incubazione in EtOH al 70% per un minimo di 24 ore fino al riutilizzo. Quando ci si prepara per una nuova coltura, asciugare gli inserti in una piastra di coltura cellulare sotto la luce ultravioletta (UV) per 15-30 minuti.
   4. Posizionare due coriandoli (sterilizzati e asciutti) su ciascuno degli inserti di coltura. Posiziona i coriandoli verso i bordi degli inserti per ottenere una sovrapposizione minima.
   5. Mettere le piastre nell'incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO₂.
4. Mezzo di dissezione a freddo a bolle con gas biossido (95% O₂/5%CO₂). Per mantenere la soluzione sterile, collegare il tubo della bombola del gas a un filtro per siringa sterile (dimensione dei pori di 0,22 μm).
   1. Accoppiare l'altra estremità del filtro della siringa a un tubo sterile collegato a una pipetta di vetro sterile. Metti la pipetta di vetro nella soluzione, coprila con parafilm e accendi il gas. Mantenere il mezzo di dissezione sul ghiaccio.
5. Preparare l'area di dissezione/affettatura.
   NOTA: Idealmente, questa procedura dovrebbe essere eseguita in una cappa sterile. Se ciò non è possibile, il vibratomo può essere lasciato su un banco da lavoro. In questo caso, si consiglia di utilizzare una retina per capelli e una maschera per il viso.
   1. Utilizzando una lama di rasoio a filo singolo, ritaglia un pezzo rettangolare (circa 2 cm x 0,5 cm) di gel di agarosio e incollalo sul tavolino del vibratomo in modo che il lato lungo sia rivolto verso la lama del vibratomo.
   2. Pulire tutte le superfici e le parti del vibratomo con il 70% di EtOH e strofinare con salviette in tessuto autoclavate.
      NOTA: È importante che tutti i pezzi che saranno a contatto con il tessuto cerebrale siano completamente asciutti poiché l'EtOH può danneggiare le cellule.
   3. Collegare una lama di rasoio sterile al vibratomo ed eseguire un controllo delle vibrazioni per vedere se il vibratomo ha questa funzione.
   4. Posizionare strumenti di dissezione autoclavati, salviette in tessuto autoclavate, quattro piccole piastre di Petri, un bisturi a bordo arrotondato, due pipette di vetro con bulbi di gomma, due pipette di vetro aperte (vedere punto 1.1) e super colla (spruzzata con EtOH) nella cappa.
   5. Versare il mezzo di dissezione a bolle nella barchetta del vibratomo e nelle quattro piccole piastre di Petri.
      NOTA: Questo passaggio dovrebbe essere fatto solo immediatamente prima della dissezione, poiché il mezzo da questo punto in poi non viene gorgogliato o tenuto in ghiaccio.
6. Seziona e monta i cervelli.
   NOTA: Per ottenere fette sane, questo passaggio deve essere fatto in modo rapido e preciso. È necessaria un po' di pratica.
   1. Eutanasia l'animale #1 mediante lussazione del collo o secondo le linee guida locali e poi decapitarlo con le grandi forbici.
   2. Usando piccole forbici affilate, rimuovi rapidamente la pelle praticando un'incisione sagittale dal collo al naso e tirala da parte per rivelare il cranio.
      1. Tagliare lungo la sutura sagittale, seguita da incisioni laterali sulla parte interna delle ossa frontali e dalla sutura lamboide (il confine tra cervello e cervelletto).
      2. Usa il forcipe per piegare il cranio su ciascun lato. I nervi cranici vengono tagliati fuori dal cervello inserendo una spatola arrotondata e affilata sotto il lato ventrale del cervello e muovendo delicatamente la spatola lateralmente.
   3. Usa una lama di rasoio a filo singolo per fare un taglio coronale rostrale al cervelletto.
      NOTA: Questo taglio determinerà l'angolo con cui vengono tagliate le fette. Dovrebbe, quindi, essere realizzato ad angolo retto.
   4. Estrarre il cervello dal cranio e metterlo in una piccola capsula di Petri contenente un mezzo di dissezione.
   5. Ripetere i passaggi 1.6.1. - 1.6.4. per l'animale #2 e metti questo cervello in una seconda capsula di Petri.
      NOTA: Gli animali non sono sterili. Eseguire la dissezione su un lato del cappuccio e poi spostarsi sull'altro lato, pulire una volta che il cervello è stato rimosso dal cranio.
   6. Cambiare i guanti.
   7. Attacca il cervello al tavolino del vibratomo: aggiungi un sottile strato di super colla al tavolino proprio di fronte al gel di agarosio montato. Tenere il cervello #1 con una grande spatola piatta con il lato appena tagliato (caudale) che tocca la spatola e il lato ventrale rivolto (e il più vicino possibile) al gel di agarosio.
      1. Quindi, posiziona delicatamente il cervello sulla colla spingendolo fuori dalla spatola con una serie di pinze. Assicurati di lasciare abbastanza spazio per il cervello #2.
         NOTA: È importante che i cervelli siano ben attaccati al tavolino ma senza eccessiva colla, poiché ciò può ostruire il taglio.
   8. Immediatamente dopo aver montato il cervello #1, usa la spatola grande per aggiungere alcune gocce di terreno di dissezione sulla parte superiore del cervello. Questo manterrà il cervello umido, indurisce la colla e impedisce che si attacchi ai lati del cervello.
   9. Ripetere i passaggi 1.6.7 e 1.6.8. per il cervello #2.
   10. Fissare il tavolino alla barca del vibratomo.
7. Tagliare fette coronali spesse 230 μm con un'ampiezza di 1 - 1,5 mm, una frequenza di 85 Hz e una velocità di 0,2 mm/s. Raccogliere fette approssimativamente tra 1,4 mm rostrali e 2,1 mm caudali a Bregma.
   1. Raccogliere le fette dopo che ogni fetta è stata tagliata utilizzando pipette di vetro aperte (pt. 1.1). Trasferire le fette in una piastra di Petri contenente un mezzo di dissezione. Con l'aiuto di un bisturi arrotondato tagliate le fette in due pezzi, dividendo le due semisfere.
8. Quando tutte le fette sono state tagliate, mettere le fette nei piatti di coltura.
   1. Estrarre il piatto di coltura (uno alla volta) dall'incubatrice.
   2. Utilizzando le pipette di vetro aperte, trasferire con cura una fetta su ciascuno dei coriandoli.
      NOTA: Le fette dovrebbero essere piatte al centro dei coriandoli. Ciò richiede una certa abilità. Tuttavia, se alcune fette non sono perfette, è meglio lasciarle piuttosto che perdere tempo a cercare di spostarle, poiché è importante mettere tutte le fette nell'incubatrice il più velocemente possibile.
   3. Utilizzare una pipetta di vetro (estremità appuntita) per rimuovere delicatamente il terreno in eccesso senza toccare la fetta.
      NOTA: Le fette non devono essere immerse in liquidi durante l'incubazione. Pertanto, il mezzo in eccesso deve essere aspirato in modo tale che le fette siano esposte all'aria (un sottile film di terreno coprirà ancora le fette). Le fette che rimangono immerse nel liquido di solito non sono sane o muoiono (4 e le nostre osservazioni).
   4. Rimetti il piatto nell'incubatrice una volta che tutti i coriandoli hanno una fetta.
   5. Ripetere i passaggi 1.7.8. - 1.8.4. per il piatto #2.
9. Modificare il supporto di coltura.
   NOTA: Questo dovrebbe essere fatto il giorno dopo l'affettatura (giorno 1 in vitro, DIV1) e poi ogni 2-3 giorni.
   1. Preriscaldare il terreno di coltura a bagnomaria o nell'incubatrice.
   2. In una cappa sterile, utilizzare l'aspirazione a vuoto o una pipetta normale con una punta sterile per aspirare il terreno di coltura da ciascun pozzetto. Questo viene fatto inclinando delicatamente la piastra (di circa 30 gradi) e posizionando la punta della pipetta sul bordo dell'inserto di coltura.
   3. Rimuovere circa 800 μl da ciascun pozzetto (lasciando una quantità di terreno sufficiente a mantenere il fondo dell'inserto coperto di terreno). Quindi, utilizzando una pipetta pulita, aggiungere 800 μl del terreno preriscaldato a ciascun pozzetto. Quindi, riposizionare le piastre nell'incubatore per colture cellulari.

2. Trasduzione virale

1. Acquista o crea virus adeno-associati (AAV) con un plasmide di interesse.
   NOTA: Questo protocollo descrive l'uso del sierotipo 2/8 AAV (AAV 2/8) che trasporta il dsred mirato mitocondriale o GFP come gene reporter sotto il controllo trascrizionale del promotore della proteina basica della mielina12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred o AAV2/8 MBP_mito_GFP) per visualizzare i mitocondri degli oligodendrociti. AAV 2/8 che trasporta GFP o tdtomato come gene reporter guidato dal promotore generale CAG (AAV 2/8 CAG_GFP o AAV 2/8 CAG_tdtomato) viene utilizzato per visualizzare il citoplasma degli oligodendrociti. Pertanto, la combinazione di AAV2/8 MBP_mito_dsred con AAV 2/8 CAG_GFP dà mitocondri rossi e citoplasma verde negli oligodendrociti, mentre la combinazione di AAV2/8 MBP_mito_GFP e AAV 2/8 CAG_tdtomato dà mitocondri verdi e citoplasma rosso. I costrutti sono descritti più dettagliatamente altrove13.
2. Il giorno 7 in vitro (DIV7), gli oligodendrociti con gli AAV vengono trasdotti.
   ATTENZIONE: Seguire le norme di sicurezza quando si lavora con gli AAV. Assicurati di avere la formazione adeguata e l'approvazione del livello di biosicurezza richiesta. Tutti i seguenti punti devono essere eseguiti in una cabina di biosicurezza di Classe II utilizzando guanti e camice da laboratorio. Qui viene descritta l'applicazione di AAV all'area della corteccia delle fette, poiché questa è l'area che mostra il miglior recupero.
   1. Diluire l'AAV in un terreno di coltura preriscaldato (37 °C). Si raccomandano diluizioni intorno a 2 × 10⁹ copie del genoma/mL (GC/mL) per ottenere una trasduzione sparsa degli oligodendrociti che consente l'imaging di singole cellule all'interno della fetta. Tuttavia, dovrebbe essere fatto un pilota utilizzando titoli diversi per garantire una densità di oligodendrociti trasdotti adatta agli esperimenti specifici. Se vengono utilizzati due AAV diversi, questi devono essere miscelati nella stessa soluzione e aggiunti contemporaneamente alla fetta.
   2. Aggiungere circa 1,3 μl di AAV diluito a ciascuna fetta. Assicurarsi che l'esterno del puntale della pipetta sia asciutto. Pipettare 1,3 μL di AAV diluito e tenere la pipetta sopra la corteccia il più vicino possibile senza toccare la fetta con la punta della pipetta (a circa 1 mm di distanza).
   3. Quindi spingere lentamente la soluzione fuori dalla pipetta. Quando la soluzione tocca la fetta, spostare la punta della pipetta sulla corteccia per distribuire la soluzione su tutta l'area della corteccia.
      NOTA: Questa procedura dovrebbe essere eseguita il più velocemente possibile per evitare di tenere le fette fuori dal cofano più a lungo del necessario. Fallo su un piatto alla volta e rimetti il primo piatto nell'incubatrice prima di iniziare con il piatto #2. Per ottenere una distribuzione soddisfacente di AAV senza danneggiare il tessuto è necessaria un po' di pratica e una mano ferma.
3. Se nel laboratorio cellulare è disponibile un microscopio a fluorescenza verticale, l'espressione proteica può essere controllata durante il periodo di coltura posizionando la capsula sotto il microscopio.
   NOTA: Il piatto non deve essere tenuto fuori dall'incubatrice per più di 2 - 5 minuti.

3. Imaging time-lapse

NOTA: L'imaging può essere eseguito ogni volta che i livelli di espressione dei marcatori fluorescenti sono sufficienti e le fette sembrano sane (di solito DIV11-14).

1. Assicurarsi che il microscopio, la perfusione e il riscaldamento siano impostati correttamente in modo che la soluzione di imaging a bolle sia riscaldata e possa entrare e uscire dal bagno.
   NOTA: Esistono varie soluzioni per le camere da bagno. Una versione semplice è presentata qui.
   1. Effettuare l'ingresso e l'uscita della vasca da bagno con aghi da siringa smussati (piegati a ~45°) che sono attaccati ai lati della vasca da bagno con blu-tack/fun tack.
   2. Assicurarsi che il tubo vada da un flacone di soluzione di imaging a bolle continue attraverso la pompa peristaltica, attraverso il tubo di riscaldamento dell'unità di riscaldamento e quindi all'ago della siringa di ingresso nel bagno.
   3. Collegare un altro tubo all'uscita dell'ago della siringa. Questo tubo passa quindi attraverso la pompa peristaltica e torna al flacone della soluzione di imaging (o a un flacone di scarto).
2. Soluzione per l'imaging a bolle con gas biossido.
   NOTA: Questo dovrebbe essere iniziato almeno 15 minuti prima dell'imaging e continuare per tutto l'esperimento.
3. Accendere la pompa peristaltica e il riscaldatore e far scorrere la soluzione attraverso il bagno per ottenere una temperatura ottimale del bagno (37 ± 0,5 °C). Assicurarsi che il sensore del termometro collegato all'unità di temperatura sia immerso nella soluzione del bagno.
4. Accendere il microscopio, la lampada a fluorescenza e i laser appropriati.
5. Impostare un percorso luminoso adatto per il campione.
   NOTA: Questo varierà a seconda della configurazione del microscopio e della sonda. È richiesta una conoscenza generale di come utilizzare il microscopio confocale e non verrà trattata qui.
6. Utilizzare un obiettivo a immersione in acqua con l'ingrandimento e l'apertura numerica appropriati (n.d.). Utilizziamo un obiettivo apocromatico piano ad immersione in acqua 40x (n.a. 1.0).
7. Aprire il foro stenopeico per ottenere una sezione ottica di circa 2 - 2,5 μm per il video time-lapse. Ciò riduce l'insorgenza di mitocondri che si spostano fuori fuoco durante il time-lapse.
8. Trasferire la fetta organotipica nel bagno:
   1. Aggiungere una goccia di soluzione di imaging o terreno di coltura a una piccola capsula di Petri di plastica.
   2. In una cappa sterile, utilizzare una pinza sterile per trasferire una fetta organotipica dall'inserto della membrana alla goccia. Le pinze devono toccare solo i coriandoli e non la fetta.
   3. Metti il coperchio sulla capsula di Petri.
   4. Rimettere immediatamente il piatto di coltura contenente il resto delle fette nell'incubatrice.
   5. Portare al microscopio una capsula di Petri contenente la fetta.
   6. Spegnere la pompa peristaltica durante il trasferimento della fetta al bagno del microscopio. Per prima cosa, usa una pinza per sollevare i coriandoli con la fetta dalla piastra di Petri alla parte superiore del bagno (i coriandoli galleggeranno). Quindi posiziona le due punte delle pinze su ciascun lato dei coriandoli in modo che tocchino i coriandoli senza toccare la fetta e spingi i coriandoli attraverso la soluzione fino al fondo della vasca. Centrare i coriandoli al centro della vasca.
   7. Usa una pinza per posizionare l'ancora di fissaggio (arpa) sopra i coriandoli senza toccare la fetta.
      NOTA: Un'arpa è un'ancora di platino a forma di ferro di cavallo che viene utilizzata per evitare che la fetta galleggi o vada alla deriva nella vasca da bagno. Per le fette acute, le corde sottili corrono da un lato all'altro dell'arpa (simile a un'arpa musicale). Per le fette organotipiche, l'arpa deve essere senza fili e adattarsi alle dimensioni dei coriandoli in modo tale da potersi adagiare sopra i coriandoli senza toccare la fetta.
   8. Riaccendere la pompa peristaltica.
9. Abbassa l'obiettivo fino al campione.
10. Seleziona la cella e la regione da immaginare.
    NOTA: Evitare un'eccessiva esposizione delle cellule alla luce laser in quanto ciò può causare tossicità cellulare (vedere i suggerimenti nei punti seguenti).
    1. Usa gli oculari e la lampada fluorescente per trovare un oligodendrocita dall'aspetto sano con l'espressione corretta. Tipicamente, gli oligodendrociti che hanno una forte sovraespressione della proteina fluorescente appaiono malsani. Gli oligodendrociti malsani avranno processi con un aspetto blobby e i mitocondri appariranno frammentati. Negli oligodendrociti sani, il soma e i processi appaiono lisci e i mitocondri hanno varie lunghezze (anche se in genere sono molto più corti rispetto ai neuroni e agli astrociti).
    2. Posiziona la cella di interesse al centro del campo visivo.
    3. Utilizzare la funzione "live" nel software (per microscopi Leica e Zeiss) per identificare la cellula sullo schermo e scegliere un'area di interesse, ad esempio una parte della cellula che contiene diversi processi primari o guaine mieliniche o un singolo processo o guaina mielinica.
       NOTA: Per essere in grado di visualizzare il più possibile i processi/guaine, scegli aree contenenti processi che giacciono relativamente piatti nella direzione x-y.
    4. Ingrandisci il campo di interesse (in genere producendo un'immagine con una dimensione dei pixel di 0,14 - 0,30 μm).
    5. Utilizzando lo strumento "regioni", disegna un rettangolo attorno all'area e scegli l'opzione per scansionare solo la regione selezionata. Il tempo di scansione, e quindi l'esposizione al laser, si riduce scansionando solo la regione selezionata.
       NOTA: Le regioni rettangolari orizzontali verranno scansionate più velocemente delle regioni verticali a causa del minor numero di linee scansionate necessarie. Se viene scansionata una regione rettangolare verticale, il tempo di scansione può essere ridotto ruotando il campo di scansione di 90 gradi (utilizzando lo strumento di rotazione).
11. Regola la potenza e il guadagno del laser per ottenere una buona visione dei mitocondri.
    NOTA: Utilizzare la potenza minima del laser necessaria. Se possibile, aumentare il guadagno piuttosto che aumentare la potenza del laser. Oltre a causare tossicità cellulare, una potenza laser troppo elevata sbianca gli oggetti ripresi nel tempo, richiedendo così un ulteriore aumento della potenza o del guadagno del laser durante la scansione. La potenza e il guadagno del laser richiesti dipenderanno dal livello di espressione e dal microscopio. Con un microscopio confocale LSM700, utilizziamo un laser da 555 nm a una potenza di 20-40 μW per l'imaging di dsred o tdtomato, mentre un laser da 488 nm viene utilizzato a 20 - 30 μW per l'imaging GFP (potenza laser misurata all'apertura posteriore dell'obiettivo). Il guadagno è impostato su un valore elevato per l'imaging dal vivo, di solito nell'intervallo 700 - 800 per GFP e 850-980 per dsred e tdtomato. L'elevato guadagno può causare un po' più di rumore di fondo, che viene rimosso aumentando l'offset digitale (i valori di offset in genere sono compresi tra 0 e 15). Nella nostra esperienza, l'utilizzo di MBP_mito_GFP fornisce un rapporto segnale/rumore migliore rispetto a MBP_mito_dsred.
12. Selezionare la velocità di scansione.
    NOTA: Ridurre al minimo il tempo di scansione utilizzando una velocità di scansione elevata e disegnando una piccola regione di scansione (vedere il punto 4.10.5 di seguito). È anche possibile risparmiare tempo di scansione eseguendo una scansione bidirezionale. Tuttavia, questa operazione non è consigliata a causa della scarsa qualità dell'immagine.
13. Impostare la frequenza e la durata della registrazione time-lapse, ad esempio acquisire immagini ogni 2 secondi per un totale di 20 minuti per l'imaging mitocondriale negli oligodendrociti.
    NOTA: La frequenza e la durata dovrebbero essere impostate in base alla mobilità degli oggetti di interesse. Una frequenza più alta esporrà il campione a una maggiore quantità di luce laser, ma gli oggetti che si muovono più velocemente richiedono anche una durata totale più breve dei video time-lapse (ad esempio, i mitocondri nei neuroni, che si muovono più frequentemente e a una velocità molto più elevata rispetto ai mitocondri negli oligodendrociti, vengono in genere ripresi ogni secondo per un totale di 2 minuti16).
14. Avvia la registrazione time-lapse.
    NOTA: I mitocondri possono spostarsi fuori fuoco e/o allontanarsi dalla regione dell'immagine durante la registrazione. Per ridurre al minimo le vibrazioni e il movimento, regolare l'interno e l'uscita del bagno e ridurre la velocità della pompa, se necessario. Di solito si verificano ancora piccoli cambiamenti nella messa a fuoco. Pertanto, è necessario un monitoraggio continuo dello schermo durante l'imaging, con piccole regolazioni della messa a fuoco durante la registrazione.

Acquisisci uno z-stack dell'intera cella per l'identificazione futura della cellula e del processo di immagine.
NOTA: Per una migliore risoluzione, il foro stenopeico dovrebbe essere reimpostato a 1 unità ariosa per lo z-stack.

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