Microscopia a due fotoni per lo studio dell'attrazione del processo microgliale verso un composto in una fetta di cervello di topo

Abstract

Fonte: Etienne, F. et al. Imaging a due fotoni dell'attrazione dei processi microgliali verso ATP o serotonina in fette cerebrali acute. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra l'uso della microscopia a due fotoni per studiare l'attrazione dei processi microgliali verso un composto iniettato in fette di cervello. Fornisce una panoramica della preparazione di fette di cervello di topo, dell'iniezione di un composto di prova chemioattrattivo e dell'imaging di microglia marcate in fluorescenza per visualizzare le loro risposte.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di rev....

Risultati

Figura 1: Dettagli della camera di interfaccia. (A) Schema per la stampa 3D del porta fette. Il diametro esterno del supporto è di 7 cm. (B) Interfaccia porta fette con la rete di nylon (freccia) che consente ai ricercatori di mantenere le fette all'interfaccia liquido-aria. (C) Dispositivo dell.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti per l'imaging della fetta<td style='border-bottom:1px solido #000000;border-right:1px solido #000000;overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> × 25 0.95 NA obiettivo ad immersione in acquaLeica Microsystems (Germania)HCX Irapo microscopio verticale MP5 a 2 fotoni con scanner risonanti (8 kHz) e due rivelatori HyD HybridLeica Microsystems (Germania) <td style='bordo-inferiore:1px solido #000000;border-right:1px solido #000000;overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> Antlia-3C Pompa peristaltica digitaleDD Biolab178961<td style='bordo-inferiore:1px solido #000000;bordo-destro:1px solido #000000;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:superiore;spazio-bianco:normale;word-wrap:break-word;strategia-avvolgente:4;'>Per la perfusione della camera a 2 fotoni con aCSFCarbogen 5% anidride carbonica/95% ossigeno<td style='bordo-inferiore:1px solido #000000;bordo-destro:1px solido #000000;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:superiore;'>Air Liquide France IndustrieI1501L50R2A001 Chameleon Ultra2 Ti:laser zaffiroCoherent (Germania) Pipette di trasferimento usa e getta, bocca largaThermoFischer scientificper esempio: 232-115.8ml con punta a pinna, ma lo abbiamo tagliato (circa 7cm) per avere una bocca di 4 mm di diametroFiltro di emissione SP680Leica Microsystems (Germania) Cubo fluorescente contenente un filtro di emissione 525/50 e un filtro dicroico 560 (per la raccolta della fluorescenza)Leica Microsystems (Germania)

Bicchiere di vetro con 50 mL di ACSF per mantenere costante la perfusione della fetta

<td style='bordo-inferiore:1px solido #000000;border-right:1px solido #000000;overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> Sistema di riscaldamentoWarner Instrument CorporationRegolatore automatico del riscaldatore TC-324B<td style='bordo-inferiore:1px solido #000000;bordo-destro:1px solido #000000;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento verticale:superiore;spazio-bianco:normale;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>per mantenere la soluzione di perfusione a 32°CCamera di perfusione fatto in casa, il file per la stampa 3D è fornito in Materiale supplementarePorta fetta ("arpa") fatto in casa: forcina di platino con i due rami uniti da fili di nylon paralleliPer la stimolazione della fetta<td style='bordo-inferiore:1px solido #000000;bordo-destro:1px solido #000000;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:superiore;'> Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idrato (ATP)SigmaA-26209da preparare estemporaneamente: 1mg/ml (3mM) soluzione madre preparata il giorno dell'esperimento, mantenuta a 4°C (alcune ore) e diluita appena prima dell'usoFluorescein (opzionale)SigmaF-6377utilizzo a 1 μM finaleMicromanipolatoreLuigs e NeumannSM7collegato alla micropipetta holdeSupporto per micropipette<td style='bordo-inferiore:1px solido #000000;bordo-destro:1px solido #000000;trabocco:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:superiore;'> uguale a quello per l'elettrofisiologiaSerotonina cloridratoSigmaH-9523aliquote di soluzione madre da 50 mM in H20 mantenute a -20°C. Soluzione da 500 μM preparata il giorno dell'esperimento.Siringa 5mL (senza ago)Terumo medical productsSS+05S1 Tubo trasparenteFischer Scientific11750105Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP TubingPer l'analisi dell'immagine <td style='bordo-inferiore:1px solido #000000;border-right:1px solido #000000;overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> Fiji https://fiji.sc GhiaccioInstitut Pasteurhttp://icy.bioimageanalysis.org topi CX3CR1-GFP mouseJung et al, 2000 maschi o femmine, da P3 a 2 mesi; Abbiamo reincrociato questi topi su sfondo 129SV.CX3CR1creER-YFP miceParkhurst et al 2013 <td style='bordo-inferiore:1px solido #000000;bordo-destro:1px solido #000000;overflow:nascosto;imbottitura:0px 3px;allineamento-verticale:superiore;spazio-bianco:normale;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>maschio o femmina, da P3 a 2 mesi; abbiamo reincrociato questi topi su sfondo 129sv.