Microscopia a due fotoni per lo studio dell'attrazione del processo microgliale verso un composto in una fetta di cervello di topo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Microscopia a due fotoni

1. Impostazione parametri<ol style='margine-fondo:0;margine-superiore:0;imbottitura-inline-inizio:48px;'>
2. Attiva il sistema multifotone (rivelatori ibridi, laser, scanner, modulatore elettro-ottico, microscopio).
3. Sintonizzare il laser a 920 nm, verificare che il laser sia in modalità bloccata e impostare la potenza al 5% - 15% e il guadagno al 10%. Ciò corrisponde a una potenza di 3 - 5 mW sotto l'obiettivo. Assicurarsi che i rivelatori non descanned siano attivati e che siano installati i filtri di emissione ed eccitazione appropriati.
4. Impostare i parametri del software di imaging sui seguenti valori: per la dimensione del fotogramma, 1024 x 1024 pixel corrispondenti a un'area di 295,07 x 295,07 μm; per lo zoom, 2. Se il segnale è molto rumoroso, applicare una media di linea pari a 2. Per la dinamica dei pixel, impostare il software di imaging a 12 bit o più.
   NOTA: Le immagini con un valore di bit più alto consentono ai ricercatori di distinguere differenze minori nell'intensità della fluorescenza rispetto alle immagini con un valore di bit più basso: una modifica di un valore di grigio in un'immagine a 8 bit corrisponderebbe a una variazione di 16 valori di grigio in un'immagine a 12 bit e di 256 valori di grigio in un'immagine a 16 bit. Pertanto, le immagini con bit più elevati sono più appropriate per l'analisi quantitativa, ma poiché le loro dimensioni aumentano con la profondità di bit, la capacità di archiviazione e la potenza di calcolo possono diventare limitanti.
5. Selezionare la modalità di scansione XYZT con un intervallo Z di 2 μm e un intervallo T di 2 min.
   NOTA: Le risoluzioni x, y e z sono determinate dal teorema del campionamento di Nyquist. Una dimensione del passo Z di circa 0,8 sarebbe ottimale per risolvere i processi della microglia (con un diametro di <1 μm), ma la risoluzione ottica della microscopia multifotone è limitante (a 920 nm con un obiettivo da 0,95 NA, la risoluzione assiale è di circa 1 μm). Oltre a quella barriera fisica, in un esperimento di imaging dal vivo, la sensibilità o il rapporto segnale/rumore, la risoluzione, la velocità e il tempo totale di osservazione contano. Tenendo conto di tutti questi parametri, sono stati selezionati un passo z di 2 μm, una dimensione dell'immagine di 1024 x 1024 pixel e un'acquisizione ad alta velocità utilizzando uno scanner risonante accoppiato a rivelatori HyD (ci vogliono circa 15 s per acquisire 50 piani z). La frequenza delle acquisizioni è di una serie XYZT ogni 2 minuti e la durata totale è di 30 minuti. Se l'impostazione non è abbastanza veloce o sensibile, è possibile ridurre la risoluzione laterale (fino a 512 x 512) o il numero di z-slice (visualizzando esclusivamente la profondità z che mostra la fluorescenza più forte [i.e., le z-slice più profonde dove la fluorescenza è debole]), o per diminuire la velocità dello scanner. La risoluzione assiale può anche essere diminuita aumentando il passo z fino a 3 μm, ma poiché ciò può influire sulla quantificazione, tutti gli esperimenti da confrontare devono essere eseguiti con lo stesso passo z.
   NOTA: È possibile eseguire esperimenti simili su fette di topi CX3CR1creER-YFP, una linea murina utilizzata per indurre la delezione genetica solo nelle microglia e in cui le microglia esprimono costitutivamente la proteina fluorescente gialla (YFP). Tuttavia, il livello di espressione di YFP è molto basso rispetto alla proteina fluorescente verde (GFP) in CX3CR1^GFP/+ topi; Pertanto, l'imaging è possibile ma impegnativo e richiede l'ottimizzazione dei parametri di acquisizione. Si consiglia di regolarli come segue.
6. Sintonizzare il laser a 970 nm (che si adatta meglio all'eccitazione YFP rispetto a 920 nm), la potenza al 50% e il guadagno al 50%, che corrisponde a una potenza laser con l'obiettivo di 5 - 6 mW.
7. Impostare una media di linea di 4 (o più) per migliorare il rapporto segnale/rumore.

2. Analisi dell'attrazione dei processi microgliali

1. Proiezione 2D e correzione della deriva<ol style='margine-inferiore:0;margine-superiore:0;imbottitura-inline-start:48px;'>
2. Apri il file (. LIF) con Figi.
3. Se necessario, crea un substack (Image/Stacks/Tools/Make Substack) con solo i piani z di interesse. Ad esempio, escludere i piani z corrispondenti alla superficie della fetta se sono stati acquisiti ma non devono essere utilizzati per l'analisi (vedere la NOTA dopo il passaggio 1.2.11) e i piani z più profondi senza fluorescenza. La pila finale contiene generalmente 90 - 110 z-slice (180 - 220 μm).
4. Avvia il Z project funzione (Immagine/Pile/Progetto Z") e seleziona il Intensità massima<span style='famiglia-carattere:Arial,sans-serif;dimensione-carattere:12pt;stile-carattere:normale;variante-carattere:normale;peso-carattere:400;decorazione-testo:nessuno;allineamento-verticale:linea di base;spazio-bianco:pre-wrap;' tipo >di proiezione per effettuare le proiezioni dello z-stack acquisite in ogni momento punto.
5. Avvia il MultiStackReg plugin (Plugin/Registrazione/MultiStackReg), selezionando Azione 1: Allineamento e Trasformazione: Corpo rigido per correggere lievi derive che potrebbero essersi verificate durante l'acquisizione. Salvare questo filmato 2D come nuovo file (.tiff).

Figura 1: Dettagli della camera di interfaccia. (A) Schema per la stampa 3D del porta fette. Il diametro esterno del supporto è di 7 cm. (B) Interfaccia porta fette con la rete di nylon (freccia) che consente ai ricercatori di mantenere le fette all'interfaccia liquido-aria. (C) Dispositivo della camera di interfaccia che consente di mantenere le fette in un ambiente carbogenato (la freccia indica il tubo per il gorgogliamento) e umidificato prima che vengano riprese.

Figura 2: Dettagli della camera di perfusione. (A) Schema per la stampa 3D. Il diametro esterno della camera di perfusione è di 5,9 cm. (B) La camera di perfusione con la rete di nylon (freccia) che sostiene la fetta, impedisce che tocchi il vetrino sottostante e permette all'aCSF di fluire sopra e sotto di essa. (C) Immagine dell'assemblaggio al microscopio a due fotoni. A destra è visibile la micropipetta che erogherà il composto localmente (asterisco). (D) Pipetta ripresa in campo chiaro. La barra della scala = 60 μm.

Figura 3: Posizione della micropipetta nella fetta. Esempio di acquisizione di una pila di immagini (nell'ippocampo di un animale di 30 giorni) con una micropipetta riempita di fluoresceina (1 μM). La fluoresceina consente di localizzare la pipetta (asterisco) nelle proiezioni massime lungo (A) l'asse z o (B) l'asse y. Si noti nel pannello B che, sebbene più deboli nella fluorescenza, ci sono anche microglia sotto la punta della pipetta. In questo esempio illustrato, per le proiezioni è stata utilizzata l'intera pila, comprese le immagini scattate nella parte più superficiale della fetta. Barra della scala = 30 μm nel pannello A e come indicato (ogni graduazione = 50 μm) nel pannello B. Lo spessore z della pila = 220 μm.

Figura 4: Esempi di esperimenti subottimali. Queste fette hanno aspettato più di 6 ore prima dell'imaging e sono state riprese dalla loro superficie superiore. (A) Esempio di uno z-stack con molti detriti (particelle grossolanamente rotonde, fluorescenti, ma con bordi irregolari; asterischi) e microglia "cespugliose" (frecce), cioè con numerosi ma brevi processi. Si notino i terminali di processo allargati (punte di freccia) che sembrano coni di crescita assonali. Lo spessore z della pila = 220 μm. Gli altri due pannelli mostrano due sotto-pile della stessa fetta, con (B) 1-30 piani z (spessore z = 59 μm) e (C) 30-120 piani z (spessore z = 180 μm). Sui piani superiori (mostrati nel pannello B), oltre ai grandi terminali di processo e detriti come nel pannello A, ci sono microglia con corpi piatti o sporgenze (stelle) insolite di grandi dimensioni. Sui piani più profondi (mostrati nel pannello C), non ci sono detriti né oggetti piatti, ma le celle sono cespugliose (frecce) e la densità è insolitamente alta. Nel complesso, queste osservazioni indicano che le microglia non sono in uno stato normale.