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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Microscopia a due fotoni
- Impostazione parametri<ol style='margine-fondo:0;margine-superiore:0;imbottitura-inline-inizio:48px;'>
- Attiva il sistema multifotone (rivelatori ibridi, laser, scanner, modulatore elettro-ottico, microscopio).
- Sintonizzare il laser a 920 nm, verificare che il laser sia in modalità bloccata e impostare la potenza al 5% - 15% e il guadagno al 10%. Ciò corrisponde a una potenza di 3 - 5 mW sotto l'obiettivo. Assicurarsi che i rivelatori non descanned siano attivati e che siano installati i filtri di emissione ed eccitazione appropriati.
- Impostare i parametri del software di imaging sui seguenti valori: per la dimensione del fotogramma, 1024 x 1024 pixel corrispondenti a un'area di 295,07 x 295,07 μm; per lo zoom, 2. Se il segnale è molto rumoroso, applicare una media di linea pari a 2. Per la dinamica dei pixel, impostare il software di imaging a 12 bit o più.
NOTA: Le immagini con un valore di bit più alto consentono ai ricercatori di distinguere differenze minori nell'intensità della fluorescenza rispetto alle immagini con un valore di bit più basso: una modifica di un valore di grigio in un'immagine a 8 bit corrisponderebbe a una variazione di 16 valori di grigio in un'immagine a 12 bit e di 256 valori di grigio in un'immagine a 16 bit. Pertanto, le immagini con bit più elevati sono più appropriate per l'analisi quantitativa, ma poiché le loro dimensioni aumentano con la profondità di bit, la capacità di archiviazione e la potenza di calcolo possono diventare limitanti. - Selezionare la modalità di scansione XYZT con un intervallo Z di 2 μm e un intervallo T di 2 min.
NOTA: Le risoluzioni x, y e z sono determinate dal teorema del campionamento di Nyquist. Una dimensione del passo Z di circa 0,8 sarebbe ottimale per risolvere i processi della microglia (con un diametro di <1 μm), ma la risoluzione ottica della microscopia multifotone è limitante (a 920 nm con un obiettivo da 0,95 NA, la risoluzione assiale è di circa 1 μm). Oltre a quella barriera fisica, in un esperimento di imaging dal vivo, la sensibilità o il rapporto segnale/rumore, la risoluzione, la velocità e il tempo totale di osservazione contano. Tenendo conto di tutti questi parametri, sono stati selezionati un passo z di 2 μm, una dimensione dell'immagine di 1024 x 1024 pixel e un'acquisizione ad alta velocità utilizzando uno scanner risonante accoppiato a rivelatori HyD (ci vogliono circa 15 s per acquisire 50 piani z). La frequenza delle acquisizioni è di una serie XYZT ogni 2 minuti e la durata totale è di 30 minuti. Se l'impostazione non è abbastanza veloce o sensibile, è possibile ridurre la risoluzione laterale (fino a 512 x 512) o il numero di z-slice (visualizzando esclusivamente la profondità z che mostra la fluorescenza più forte [i.e., le z-slice più profonde dove la fluorescenza è debole]), o per diminuire la velocità dello scanner. La risoluzione assiale può anche essere diminuita aumentando il passo z fino a 3 μm, ma poiché ciò può influire sulla quantificazione, tutti gli esperimenti da confrontare devono essere eseguiti con lo stesso passo z.
NOTA: È possibile eseguire esperimenti simili su fette di topi CX3CR1creER-YFP, una linea murina utilizzata per indurre la delezione genetica solo nelle microglia e in cui le microglia esprimono costitutivamente la proteina fluorescente gialla (YFP). Tuttavia, il livello di espressione di YFP è molto basso rispetto alla proteina fluorescente verde (GFP) in CX3CR1GFP/+ topi; Pertanto, l'imaging è possibile ma impegnativo e richiede l'ottimizzazione dei parametri di acquisizione. Si consiglia di regolarli come segue. - Sintonizzare il laser a 970 nm (che si adatta meglio all'eccitazione YFP rispetto a 920 nm), la potenza al 50% e il guadagno al 50%, che corrisponde a una potenza laser con l'obiettivo di 5 - 6 mW.
- Impostare una media di linea di 4 (o più) per migliorare il rapporto segnale/rumore.
Posizionamento della fetta e della micropipetta di vetro, e l'applicazione locale del composto- Collega la pompa peristaltica alla camera di registrazione, 30 minuti prima di iniziare la registrazione. Dopo aver pulito l'intero sistema di perfusione con 50 mL di acqua ultrapura, iniziare la perfusione della camera di registrazione con aCSF (50 mL) contenuto in un becher di vetro sotto costante carbogenazione. Durante l'esperimento, mantenere l'aCSF circolante a 32 °C con un microriscaldatore in linea o un riscaldatore di Peltier.
NOTA: Una specifica camera di perfusione con perfusione superiore e inferiore è progettata per ottimizzare l'ossigenazione su entrambi i lati della fetta. La camera di perfusione è composta da due parti perfettamente aderenti, con una rete di poliammide tesa tra di loro (Figura 1A,B). Rispetto ad altri tipi di camere, in cui la fetta è adagiata direttamente su un vetrino coprioggetti, questa camera riduce la morte neuronale nella parte inferiore della fetta, migliora la vitalità e riduce i movimenti della fetta indotti dal suo rigonfiamento. - Con una pipetta di trasferimento monouso a bocca larga, trasferire la fetta di cervello da visualizzare nel becher aCSF per rimuovere la carta per lenti, lasciarla affondare (come prova che non è attaccata alcuna bolla d'aria) e trasferirla nella camera di registrazione (perfusione).
- Posizionare un portafette (una forcina in platino con i due rami uniti da fili di nylon paralleli) sulla fetta per ridurre al minimo il movimento della fetta dovuto al flusso di perfusione.
- Utilizzare l'illuminazione a campo chiaro per mirare alla regione cerebrale di interesse (tempo di esposizione: da 50 a 80 ms) utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (5X o 10X). Passa all'obiettivo a immersione in acqua con ingrandimento più elevato (25x con obiettivo 0,35x) e regola la posizione.
NOTA: Evitare di visualizzare i campi vicino ai fili di nylon del portafette, in quanto possono bloccare la luce e deformare localmente la fetta. Assicurati che l'area di interesse sia pianeggiante. Se necessario, rimuovere il portafette per riposizionare la fetta e/o il porta fette. - Utilizzare l'illuminazione a fluorescenza per localizzare le cellule microgliali fluorescenti da visualizzare sul campo (tempo di esposizione: 250 - 500 ms).
NOTA: Questo passaggio consente ai ricercatori di verificare la presenza di cellule nella regione di interesse e la loro intensità di fluorescenza e di controllare la quantità di detriti cellulari. - Riempire nuovamente la pipetta con 10 μl di aCSF con ATP, 5-HT o il farmaco di interesse alla sua concentrazione finale. Puntare il puntale verso il basso e agitare delicatamente la pipetta piena di farmaco per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nel puntale.
NOTA: Se la soluzione da iniettare tende a formare bolle, prendere in considerazione l'utilizzo di pipette in borosilicato con filamento interno. La fuoriuscita di ATP dalla pipetta può attirare i processi microgliali anche prima dell'iniezione (se ciò si verifica, sarà visibile nella fase di analisi). Anche se questo dovrebbe essere moderato con la concentrazione di ATP utilizzata (500 μmol·L-1), in caso di problemi, prendere in considerazione la possibilità di preriempire la micropipetta con 2 mL di aCSF prima di aggiungere la soluzione di ATP (o altro composto) al passaggio 1.2.6. - Montare la pipetta piena in un portapipetta, collegato con un tubo trasparente a una siringa da 5 ml, con uno stantuffo posizionato nella posizione di 5 ml. Il portapipetta stesso è montato su un micromanipolatore a tre assi.
- In condizioni di illuminazione a campo chiaro, utilizzare il micromanipolatore per posizionare la pipetta al centro del campo. Per una centratura riproducibile e ottimale, visualizzare e utilizzare i righelli sull'immagine.
- Abbassare delicatamente la pipetta verso la fetta, controllando e regolando l'obiettivo allo stesso tempo fino a quando la punta della pipetta tocca leggermente la superficie della fetta. Arrestare la discesa della pipetta non appena è visibile che la fetta è stata toccata, consente alla punta della pipetta di penetrare 80 - 100 μm della superficie della fetta (vedi Figura 2B).
- Sintonizzare il laser (vedere i parametri sopra) e passare il microscopio alla modalità multifotone. Assicurarsi che la camera sia schermata da qualsiasi fonte di luce (ad esempio, lo schermo di un computer). Accendere i rilevatori non descanned e impostare il guadagno. Utilizzare una tabella di ricerca (LUT) con un limite superiore codificato a colori per evitare di saturare i pixel nell'immagine.
- Determinare lo spessore della fetta da visualizzare (cioè le posizioni z superiore e inferiore in cui la fluorescenza è rilevabile [di solito tra 220 e 290 μm in totale]).
NOTA: Sulla superficie della fetta c'è una maggiore densità di processi e possibilmente di microglia, spesso con una morfologia insolita, rispetto all'interno della fetta. Questo accumulo sarà più sorprendente con il tempo (ad esempio., più visibile nell'ultima che nella prima fetta di cervello ad essere fotografata). Pertanto, i piani z nei primi ~30 μm non devono essere utilizzati per l'analisi e possono anche essere saltati per l'acquisizione. - Iniziare a registrare per una durata totale di 30 minuti (o più se lo si desidera) e dopo una linea di base di 5 minuti, applicare localmente il composto da testare (senza interrompere l'imaging). Per fare ciò, premere lentamente lo stantuffo della siringa collegata alla micropipetta, dalla posizione di 5 mL a quella di 1 mL (in circa 5 s). La resistenza quando si preme lo stantuffo deve essere avvertita immediatamente. In caso contrario, la punta potrebbe essere rotta.
NOTA: Per uno sperimentatore addestrato, le iniezioni con questo metodo sono riproducibili, ma in alternativa alla manipolazione manuale di una siringa, la pipetta potrebbe essere collegata a un sistema automatizzato di espulsione a pressione per consentire un migliore controllo del volume erogato. L'iniezione crea una distorsione fisica della fetta nel sito dell'iniezione. Questa distorsione è visibile a posteriori nelle prime due o tre immagini dopo l'iniezione, ma non dovrebbe essere visibile nella quarta immagine (cioè 8 minuti dopo l'iniezione). Se persiste, prendere in considerazione la possibilità di modificare i parametri per la preparazione della pipetta. - Al termine dell'acquisizione (30 min), gettare la micropipetta e rimuovere la fetta.
- Prima di iniziare a fotografare una nuova fetta, fare il filmato 2D (sezione 2.1) per verificare che le microglia abbiano una morfologia normale e si muovano e, quindi, che le fette siano sane.
2. Analisi dell'attrazione dei processi microgliali
- Proiezione 2D e correzione della deriva<ol style='margine-inferiore:0;margine-superiore:0;imbottitura-inline-start:48px;'>
- Apri il file (. LIF) con Figi.
- Se necessario, crea un substack (Image/Stacks/Tools/Make Substack) con solo i piani z di interesse. Ad esempio, escludere i piani z corrispondenti alla superficie della fetta se sono stati acquisiti ma non devono essere utilizzati per l'analisi (vedere la NOTA dopo il passaggio 1.2.11) e i piani z più profondi senza fluorescenza. La pila finale contiene generalmente 90 - 110 z-slice (180 - 220 μm).
- Avvia il Z project funzione (Immagine/Pile/Progetto Z") e seleziona il Intensità massima<span style='famiglia-carattere:Arial,sans-serif;dimensione-carattere:12pt;stile-carattere:normale;variante-carattere:normale;peso-carattere:400;decorazione-testo:nessuno;allineamento-verticale:linea di base;spazio-bianco:pre-wrap;' tipo >di proiezione per effettuare le proiezioni dello z-stack acquisite in ogni momento punto.
- Avvia il MultiStackReg plugin (Plugin/Registrazione/MultiStackReg), selezionando Azione 1: Allineamento e Trasformazione: Corpo rigido per correggere lievi derive che potrebbero essersi verificate durante l'acquisizione. Salvare questo filmato 2D come nuovo file (.tiff).
Elaborazione dati- Apri questo nuovo file con Icy.
- Disegna un <span style='famiglia di caratteri:Arial,sans-serif;dimensione-carattere:12pt;stile-carattere:normale;variante-carattere:normale;decorazione-testo:nessuno;allineamento-verticale:linea di base;spazio-bianco:pre-wrap;'>R1 regione di interesse (ROI) di 35 μm di diametro, centrata sul sito di iniezione (identificata in particolare dall'ombra della pipetta e dalla distorsione creata al momento dell'iniezione).
- Usa il plugin ROI intensity evolution e misura l'intensità media su tempo in R1.
- Salvare i risultati in un file .XLS.
Quantificazione e rappresentazione dei risultati- Per quantificare la risposta microgliale nel tempo, determinare in ogni momento.
Allora, i risultati possono essere rappresentati come una cinetica della risposta microgliale, o in un punto temporale specifico (vedi Figura 3).
