Imaging microscopico di neuroni in una sezione cerebrale di topo utilizzando la colorazione metallica di Golgi-Cox

Abstract

Fonte: Louth, E. L., et al. Imaging di neuroni all'interno di sezioni cerebrali spesse utilizzando il metodo Golgi-Cox. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra l'imaging dei neuroni in una sezione spessa del cervello colorata di Golgi-Cox impostando i limiti di messa a fuoco superiore e inferiore e catturando immagini sovrapposte. Vengono riprodotte più posizioni per garantire proiezioni neuronali dettagliate, che vengono combinate per creare una rappresentazione 3D.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Colorazione

1. Golgi-CoxImpregnazione di cervelli Golgi-Cox
   1. Crea la soluzione di Golgi-Cox di bicromato di potassio all'1% (p/v), cromato di potassio allo 0,8% (p/v) e cloruro mercurico all'1% (p/v) sciogliendo il bicromato di potassio e cromato di potassio separatamente in acqua di alta qualità. Mescolare le soluzioni, aggiungere il cloruro di mercurio e filtrare la soluzione finale utilizzando carta da filtro di grado 1. Conservare la soluzione al buio per un massimo di un mese.
   2. Anestetizza il mouse usando isoflurano al 5%.
   3. Eutanasia del topo per decapitazione e rimuovi rapidamente il cervello.
   4. Metti il cervello in una fiala di vetro scintillante da 20 ml contenente 17 ml di soluzione di Golgi-Cox e incuba al buio a RT per 25 giorni.
   5. Crioproteggi il cervello inserendolo in una provetta conica da 50 ml contenente 40 ml di saccarosio crioprotettore (30% (p/v) di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4) al buio a 4 °C per 24 ore.
      NOTA: I seguenti tre passaggi opzionali possono essere impiegati come alternativa al protocollo principale, al fine di congelare il cervello in questa fase per l'archiviazione a lungo termine.
   6. Congela l'intero cervello immergendolo in 200 ml di isopentano preraffreddato su ghiaccio secco.
   7. Posiziona il cervello congelato in una provetta conica da 50 ml e conservalo al buio a -80 °C.
   8. Quando sei pronto per procedere, scongela il cervello mettendolo in una provetta conica da 50 ml contenente 40 ml di saccarosio crioprotettore e tenendolo al buio a 4 °C per 24 ore.
2. Sezionamento del cervello
   Rimuovi il cervello dal saccarosio e bloccalo per il sezionamento tagliando il cervelletto usando una lama di rasoio e lasciando un bordo piatto all'estremità caudale rimanente del cervello.
   1. Scalda l'agar (3% (p/v) in acqua) fino a quando non si scioglie, poi lascialo raffreddare fino a quando non supera leggermente il suo punto di fusione.
   2. Metti il cervello in un piccolo piatto usa e getta con l'estremità caudale rivolta verso il basso, e aggiungi una quantità sufficiente di agar fuso per coprirlo.
   3. Una volta che l'agar si è solidificato, taglia l'agar in eccesso, lasciando circa 2 - 4 mm intorno al cervello, e incolla il cervello al palco di un vibratomo con l'estremità caudale rivolta verso il basso usando una piccola quantità di colla cianoacrilato di etile.
   4. Riempi l'area del palco del vibratomo con una quantità sufficiente di saccarosio crioprotettore per coprire il cervello, e seziona il cervello con uno spessore di fetta di 400 - 500 μm (a seconda della regione del cervello da esaminare) utilizzando una frequenza di vibrazione di 86 Hz e una velocità di avanzamento della lama di 0.125 mm/s.
   5. Usando un piccolo pennello, posiziona le sezioni cerebrali in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti contenente inserti a fondo rete disponibili in commercio e pre-riempita con 10 mL di saccarosio al 6% (p/v) in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4.
   6. Incuba le sezioni al buio a 4 °C O/N.
3. Sviluppo di sezioni cerebrali
   1. Trasferisci le sezioni cerebrali in un nuovo pozzetto contenente 5 mL di paraformaldeide (PBD) al 2% (p/v) in tampone fosfato 0.1M, pH 7.4, utilizzando gli inserti del fondo della rete. Incubare su un bilanciere, muovendosi lentamente al buio a RT per 15 minuti.
   2. Le sezioni dovrebbero essere lavate due volte trasferendole in nuovi pozzetti contenenti 5 ml di acqua. Devono essere lavati su un bilanciere che si muove a velocità moderata al buio a RT per 5 minuti.
   3. Trasferisci le sezioni in un nuovo pozzetto contenente 5 mL di idrossido di ammonio al 2,7% (v/v). Incubare su un bilanciere, muovendosi lentamente al buio a RT per 15 minuti.
   4. Le sezioni dovrebbero essere lavate due volte trasferendole in nuovi pozzetti contenenti 5 ml di acqua. Devono essere lavati su un bilanciere che si muove a velocità moderata al buio a RT per 5 minuti.
   5. Trasferisci le sezioni in un nuovo pozzetto contenente 5 ml di Fissativo A diluito in acqua 10 volte dalla sua concentrazione originale acquistata. Incubare su un bilanciere, muovendosi lentamente al buio a RT per 25 minuti.
   6. Le sezioni dovrebbero essere lavate due volte trasferendole in nuovi pozzetti contenenti 5 ml di acqua. Devono essere lavati su un bilanciere che si muove a velocità moderata al buio a RT per 5 minuti.
4. Montaggio di Brain Sections
   1. Usando un piccolo pennello, monta le sezioni sui vetrini del microscopio. Usando una pinzetta e un piccolo fazzoletto, rimuovere l'acqua in eccesso e l'agar. Assicurarsi che tutto l'agar sia stato rimosso prima di procedere con la disidratazione.
   2. Lascia asciugare le sezioni all'aria a RT per circa 45 min (sezioni da 400 μm) o 90 min (sezioni da 500 μm).
      NOTA: I tempi e il corretto livello di asciugatura sono critici e potrebbe essere necessario determinarli in ogni laboratorio a seconda della temperatura e dell'umidità dell'ambiente. Un tempo di asciugatura troppo breve porta alla caduta delle sezioni dai vetrini durante le successive fasi di disidratazione, mentre un tempo di asciugatura troppo lungo porta alla rottura delle sezioni. Le sezioni appariranno ancora lucide al livello di secchezza appropriato.
   3. Colora le sezioni con il cresyl violet inserendo i vetrini nei barattoli di colorazione Coplin come indicato.
      NOTA: Questo passaggio opzionale può essere utilizzato per sezioni che non sono mai state congelate per colorare i nuclei neuronali con cresyl violet. Abbiamo scoperto che la pulizia e la reidratazione delle sezioni prima dell'incubazione nel cresyl violet porta a una colorazione uniforme e a un basso fondo tra le sezioni.
      1. Metti in agente di pulizia per 5 min. Ripeti una volta.
      2. Metti in etanolo al 100% per 5 min. Ripeti una volta.
      3. Metti il 95% di etanolo in acqua, poi il 75% di etanolo in acqua, e poi il 50% di etanolo in acqua per 2 minuti ciascuno.
      4. Metti in acqua per 5 min.
      5. Metti in viola cresyl allo 0,5% (w/v) in acqua per 7 min.
      6. Metti in acqua per 2 min. Ripeti una volta.
   4. Disidrata le sezioni inserendo i vetrini nei barattoli di colorazione Coplin come indicato.
      1. Metti il 50% di etanolo in acqua, poi il 75% di etanolo in acqua, e poi il 95% di etanolo in acqua per 2 minuti ciascuno.
      2. Metti in etanolo al 100% per 5 min. Ripeti una volta.
      3. Metti in agente detergente per 5 min. Ripeti una volta.
         NOTA: Questi tempi di disidratazione e schiarimento sono sufficienti per elaborare i cervelli dei topi come descritto in questo manoscritto. Tuttavia, abbiamo osservato che per altre specie, tra cui ratti e cowbird, potrebbe essere necessario prolungare la fase finale di sgombero fino a 15 minuti in totale.
   5. Sezioni del vetrino coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio anidro.
   6. Lascia asciugare le diapositive orizzontalmente al buio a RT per almeno 5 giorni.

2. Imaging di neuroni macchiati all'interno di sezioni

1. cerebrali spesseCattura di pile di immagini style='list-style-type:decimal;'><
2. span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>Accendi la lampadina del microscopio, la fotocamera e il controller di scena.
3. Apri il software del microscopio (ad esempio, Neurolucida).
4. Posiziona un vetrino sul tavolino del microscopio.
5. Cattura un'immagine 2D wide-view della sezione del cervello utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento come 1.25X 0.4 N.A. PlanAPO o 4X 0.16 N.A.
   1. Concentrati sull'immagine e regola le impostazioni della fotocamera, incluso il tempo di esposizione e il bilanciamento del bianco.
   2. Crea un punto di riferimento facendo clic con il pulsante sinistro del mouse in un punto qualsiasi della sezione
   3. Cattura l'immagine selezionando "acquisisci immagine singola" all'interno della finestra di acquisizione dell'immagine.
6. Cattura pile di immagini a media risoluzione dell'area contenente i neuroni di interesse utilizzando un obiettivo 10X 0.3 N.A. UPlan FL N. N.
   1. Concentrati sull'immagine e regola le impostazioni della fotocamera, inclusi l'esposizione e il bilanciamento del bianco.
   2. Imposta i limiti superiore e inferiore per la pila di immagini concentrandoti sulla parte superiore della sezione e selezionando "imposta" accanto a "parte superiore della pila" all'interno della finestra di acquisizione dell'immagine, quindi concentrandoti sulla parte inferiore della sezione e selezionando "imposta" accanto a "fondo della pila" all'interno della finestra di acquisizione dell'immagine.
   3. Imposta la distanza del passo a 5 μm inserendo "5 μm" accanto a "distanza tra le immagini" all'interno della finestra di acquisizione dell'immagine.
   4. Cattura la pila di immagini selezionando "acquisisci pila di immagini" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
   5. Ripeti i passaggi precedenti per catturare l'intera area di interesse, assicurandoti che tutte le pile di immagini si sovrappongano di almeno il 10% negli assi X e Y.
7. Cattura pile di immagini ad alta risoluzione dell'area contenente il neurone di interesse utilizzando un obiettivo a immersione in olio di silicone 30X 1.05 N.A.
   1. Applica 3 - 4 gocce di olio da immersione in silicone al vetrino e posiziona l'obiettivo sopra il vetrino, assicurandoti il contatto tra l'obiettivo e l'olio.
   2. Concentrati sull'immagine e regola le impostazioni della fotocamera, inclusa l'esposizione e il bilanciamento del bianco.
   3. Imposta i limiti superiore e inferiore per la pila di immagini concentrandoti sulla parte superiore della sezione e selezionando "imposta" accanto a "parte superiore della pila" all'interno della finestra di acquisizione dell'immagine, quindi concentrandoti sulla parte inferiore della sezione e selezionando "imposta" accanto a "fondo della pila" all'interno della finestra di acquisizione dell'immagine.
   4. Imposta la distanza del passo a 1 μm inserendo "1 μm" accanto a "distanza tra le immagini" all'interno della finestra di acquisizione dell'immagine.
   5. Cattura la pila di immagini selezionando "acquisisci pila di immagini" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
   6. Ripeti i passaggi precedenti per catturare l'intera area di interesse, assicurandoti che tutte le pile di immagini si sovrappongano di almeno il 10% negli assi X e Y.
8. Salva il file di dati e tutti i file immagine in formato TIFF per l'elaborazione esterna.

Creazione di immagini Z-projection e montaggi di immagini

1. Crea immagini Z-projection in ImageJ
   1. Apri il software ImageJ che ha installato il plugin Bio-Formats.
   2. Seleziona "Plugins" -> "Bio-Formats" -> "Bio-Formats Importer."
   3. Seleziona il file della pila di immagini da aprire.
   4. Una volta aperto il file, cambia il formato in RGB selezionando "Immagine" -> "Tipo" -> "Colore RGB".
   5. Crea la proiezione Z selezionando "Immagine" -> "Pile" -> "Progetto Z...".
   6. Salva l'immagine bidimensionale della proiezione Z come file TIFF.
2. Crea un montaggio di immagini bidimensionali dell'intera area di interesse.
   1. Apri il software (ad esempio, Adobe Photoshop).
   2. Seleziona "File" -> "Automatizza" -> "Photomerge".
   3. Seleziona "Sfoglia" e poi aggiungi tutti i file immagine da unire.
   4. Assicurati che "Fondi immagini" sia selezionato e poi seleziona "OK".
   5. Salva l'immagine di montaggio risultante dell'intera area di interesse come file TIFF.

Materiali