Imaging dell'attivazione neuronale dell'ippocampo nelle sezioni del cervello del topo

Abstract

Fonte: Provenzano, G., et al. Visualizzazione immunoistochimica dell'attività dei neuroni ippocampali dopo l'apprendimento spaziale in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra l'imaging immunoistochimico per visualizzare l'attivazione neuronale dell'ippocampo. Le sezioni cerebrali colorate rivelano regioni più scure al microscopio a campo chiaro, indicando neuroni attivati.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Immunoistochimica

1. Trasferire 3-5 sezioni ippocampali dorsali per ciascun topo in 24 piastre multipozzetto contenenti 500 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 0,1 M per ciascun pozzetto.
2. Lavare le sezioni contenute in ciascun pozzetto con 500 μl di 0,1 M PBS (5 min, 3 volte agitando delicatamente).
3. Estinguere l'attività endogena della perossidasi incubando sezioni in perossido di idrogeno all'1% (H₂O₂) in PBS per 20 minuti con leggera agitazione.
4. Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min).
5. Permeabilizzazione dei tessuti: incubare sezioni per 5 minuti in Triton X-100 allo 0,2% in PBS.
6. Durante i passaggi precedenti (1,4; 1,5), preparare una quantità sufficiente di tampone bloccante (10% siero di capra e 0,1% Triton-X100 in PBS) per l'intero esperimento (numero di sezioni x 100 μl x 3 passaggi).
7. NOTA: Utilizzare siero della stessa specie in cui è stato prodotto l'anticorpo secondario (Ab) (coniugato alla biotina).
8. Prevenire il legame non specifico dell'anticorpo incubando le sezioni in un tampone bloccante (100 μl/sezione) per 1 ora a temperatura ambiente (RT) con una leggera agitazione.
9. Incubare sezioni nella chinasi primaria Ab fosforilata extracellulare regolata dal segnale (pERK) diluita in tampone bloccante per una notte a 4 °C, con leggera agitazione.
10. Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min).
11. Incubare con il corpo antiaderente secondario coniugato con biotina (1:250) diluito in tampone bloccante (lo stesso utilizzato al punto 1.6) per 1 ora a RT con leggera agitazione.
12. Preparare contemporaneamente il reagente del complesso avidina-biotina (ABC), poiché avidina e biotina richiedono almeno 30 minuti a temperatura ambiente per complessare.
13. Preparare il volume richiesto di reagente ABC secondo il protocollo del produttore.
14. Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min).
15. Incubare le sezioni per 45 minuti a RT con il reagente ABC.
16. Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min).
17. Per preparare una soluzione di lavoro a base di diaminobenzidina (DAB), ogni passaggio che coinvolge il DAB deve essere eseguito nella cappa aspirante, poiché il DAB è cancerogeno e teratogeno.
18. Trasferire la soluzione DAB in una nuova piastra con una pipetta di trasferimento in plastica.
19. Posizionare le sezioni nella lastra contenente la soluzione di lavoro DAB e far roteare lentamente la lastra a mano per consentire la massima esposizione alle sezioni.
20. Monitorare la reazione DAB al microscopio fino a quando non si sviluppa un segnale adeguato (2-5 minuti).
21. Arrestare la reazione all'intensità di colore desiderata lavando il fazzoletto a 0,1 M PBS (3 x 5 min).
22. Utilizzare candeggina per disattivare l'eventuale soluzione di substrato DAB rimanente nella cappa aspirante durante la notte e smaltirla secondo le linee guida del laboratorio.
23. Monta sezioni su vetrini rivestiti di gelatina facendoli galleggiare in PBS. Poi, asciugateli a temperatura ambiente per almeno 3-4 ore.
24. Disidratare le sezioni in sequenza in etanolo al 50%, 70%, 95% e 100% per 2 minuti ciascuna e illimpidire in xilene al 100% per 5 minuti.
25. Vetrino coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio e lasciare asciugare in una cappa aspirante per una notte.

Materiali

24 well plate	Sigma	CLS3524
100% etanolo	Fisher Scientific	A406-20	Utilizzato per fare gradiente di etanolo per la disidratazione prima del montaggio della diapositiva.
Xylene	VWR	66004-950<
PBS	Sigma	P3813-10PAK
Triton X-100	Sigma	T-8787
Perossido di idrogeno	Sigma	H1009-100ML
Siero di capra normale	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Aggiungere in un volume di 5 ml di PBS 2 gocce di reagente A, mescolare e poi aggiungere 2 gocce di reagente B e mescolare.
Substrato di perossidasi DAB	Vector Laboratories	SK-4100	Aggiungi un volume di 5 ml di acqua distillata doppia: 2 gocce di soluzione tampone e mescola; 4 gocce di DAB e mescola; 2 gocce di perossido di idrogeno e mescola.
pERK anticorpo	Cell Signaling Technologies	4370	Diluizione 1:500
Capra biotinilata anti-coniglio anticorpo IgG	Vector Laboratories	BA-1000	Diluizione 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Supporto di montaggio per diapositive. È possibile utilizzare un mezzo di montaggio equivalente.

td style='larghezza:311pt;'>Tossico - da usare sotto il cofano. Cambia lo xilene ogni mese a seconda dell'uso.