Imaging della dinamica intracellulare dell'ATP utilizzando sensori basati su FRET in una fetta di ippocampo di topo organotipico

Abstract

Fonte: Lerchundi, R., et. al. Imaging dell'ATP intracellulare in fette di tessuto organotipico del cervello di topo utilizzando il sensore basato su FRET ATeam1.03YEMK. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra l'uso di sensori basati su FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) per misurare i livelli intracellulari di ATP in fette organotipiche di ippocampo di topo, consentendo la visualizzazione in tempo reale delle dinamiche dell'ATP nei neuroni e negli astrociti in condizioni fisiologiche e sperimentali.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Imaging ATP basato su FRET (Figura 1)

1. Prima dell'esperimento, preparare E-ACSF e bollarlo con 95% O₂/5% CO₂ per almeno 30 minuti per ottenere un pH di 7,4. Accendere la sorgente luminosa fluorescente (lampada allo xeno) del monocromatore (Figura 1). Iniziare la perfusione poco prima di estrarre la fetta dall'incubatrice.
   NOTA: Mantieni la soluzione salina a bolle con il 95% di O₂ e il 5% di CO₂ durante l'intero esperimento.
2. Trasferire la fetta in una camera sperimentale che viene costantemente perfusa con E-ACSF appena carbogenato utilizzando una pompa peristaltica (Figura 1). Quindi, fissa la fetta con una griglia. Posizionare la camera sul tavolino del microscopio e collegare il sistema di perfusione. Per la perfusione si consigliano tubi da laboratorio a prova di gas.
   NOTA: Gli esperimenti possono essere eseguiti a temperatura ambiente o vicino alla temperatura fisiologica, a seconda del disegno sperimentale. Verificare la stabilità e l'affidabilità del flusso di perfusione per evitare cambiamenti di messa a fuoco indotti dal movimento del tessuto e/o cambiamenti nello sforzo di taglio. Le velocità di perfusione standard per il lavoro su fette, utilizzate da noi e da molti altri laboratori, sono 1,5-2,5 mL/min.
3. Mettere a fuoco la fetta coltivata utilizzando una luce di trasmissione. Identificare l'area in cui devono essere eseguiti gli esperimenti (ad esempio: la regione CA1 dell'ippocampo). Prima di iniziare gli esperimenti di imaging, attendere almeno 15 minuti per consentire alle fette di adattarsi alle condizioni saline. Per la configurazione della configurazione sperimentale, vedere Figura 1.
4. Accendere la fotocamera e il software di imaging. Quindi, seleziona il cubo filtro appropriato.
5. Eccitare la proteina fluorescente del donatore (eCFP) a 435/17 nm (~435 nm). Impostare il tempo di esposizione tra 40 e 90 ms.
   NOTA: Una forte esposizione delle fette alla luce fluorescente può provocare effetti fototossici.
6. L'eccitazione a 435 nm provoca emissioni sia a 475 nm (eCFP; donatore) che a 527 nm (Venere; accettore). Suddividere l'emissione di fluorescenza a 500 nm con uno splitter di immagini di emissione e utilizzare filtri passa-banda a 483/32 e 542/27 per isolare ulteriormente la fluorescenza del donatore e dell'accettore. Un'espressione forte potrebbe provocare la saturazione dei rilevatori. In questo caso, è possibile utilizzare un filtro a densità neutra per ridurre l'intensità dell'eccitazione.
7. Selezionare una regione di interesse (ROI) apparentemente priva di fluorescenza cellulare per la sottrazione di fondo. Quindi, crea ROI che delineano i corpi cellulari.
8. Impostare la frequenza di acquisizione dell'immagine e il tempo di registrazione complessivo. Per esperimenti lunghi (>30 minuti), si consiglia una frequenza di acquisizione di 0,2-0,5 Hz per prevenire la fototossicità.
9. Avvia la registrazione. Si consiglia di registrare almeno 5 minuti in condizioni basali per garantire la stabilità della preparazione.
   NOTA: Regola la messa a fuoco della cella durante la registrazione, se necessario.

Risultati

Figura 1: Configurazione della configurazione di imaging FRET. (A) Illustrazione schematica dei diversi componenti e della loro disposizione spaziale necessaria per la configurazi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-deoxyglucose	Alfa Aesar	L07338	Analogo
Filtri passa banda 483/32	AHF Analysentechnik AG		Filtro
Filtri passa banda 542/27	AHF Analysentechnik AG		Filtro di emissione compatibile con splitter
Beamsplitter T 455 LP	AHF Analysentechnik AG		Specchio dicroico
Beamsplitter T 505 LPXR	AHF Analysentechnik AG		Splitter dichroic
Elaborazione dati Origin Pro 9.0.0 (64- bit)	OriginLab corporation		Software scientifico per grafici e analisi
D-glucosio monoidrato	Caelo	2580-1kg	<
GIBCO/Life	14190250	Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco
Eclipse E 600FN microscopio verticale	Nikon Microscope Solutions			Eclipse FN1 upright microscope	Nikon Microscope Solutions
Camera sperimentale	custom build		Camera di perfusione per imaging
Hanks' Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H9394	Con rosso fenolo per il monitoraggio
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma-Aldrich	M7278	Synthetic cell culture media<
Thermo Scientific/FEI		Ultra veloce Commutazione Monochromator
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0	Nikon Microscope Solutions		Obiettivo
NIS Elements 4.50 advanced Research	Nikon Microscope Solutions		Software di imaging. Versione aggiornata per l'imaging
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics		Fotocamera
Tubo di perfusione	Pro Liquid GmbH		Tubo Tygon, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)
Photoshop CS 6 Versione 13.0	Adobe		Software di elaborazione delle
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)	ETH Zürich	v244	Vettore AAV a filamento singolo che induce l'espressione di ATeam1.03YEMK sotto il controllo del frammento promotore della sinapsina 1 umana hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)	ETH Zürich	v307	Vettore AAV a filamento singolo che induce l'espressione di ATeam1.03YEMK sotto il controllo del frammento del promotore della proteina acida fibrillare gliale umana ABC1D.

del glucosio non metabolizzabile di emissione compatibile con splitter di eccitazione dei datitd style='height:14.5pt;width:204pt;'>DPBS su cellule vive del pHtd style='height:15.75pt;width:204pt;'>Monochromator Polychrome V per microscopio ad immersione in acqua FRET CMOS digitale immagini